酶联免疫法ELISA最直白讲解

007 · 发表于 2017-11-11 02:45

登陆有奖并可浏览互动！

您需要登录才可以下载或查看，没有账号？立即注册

×

上篇文章介绍了怎么找工作，如果想找IVD方向的工作，那ELISA应该是你入门的门槛了。先说下ELISA是什么，从名字中可以看出，是两个反应（酶促反应和免疫反应）连在一起，免疫反应就是抗原抗体反应，酶促反应就是生物显色反应，目前国内常用的血液、尿液中一些指标检测方法都是这个，包括板式化学发光、胶体金（早早孕就是这个方法）也是基于这个原理的。因为抗原抗体发生了反应，你是无法看到的，所以连接上酶反应，用颜色变化来让你知道免疫反应发生强弱。目前ELISA包括直接法、间接法、夹心法、竞争法，最常用的就是间接法、夹心法。酶促反应中常用的酶是辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），HRP是从辣根中提取的，ALP是从大肠杆菌或小牛肠粘膜提取的，底物一般为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD），还要加入过氧化氢作为催化剂。

笔者也到车间生产过ELISA试剂盒，下面就给同学们讲下，首先将抗原溶于缓冲液中，包被在96孔板上，蛋白会结合到孔壁上，之后用牛血清蛋白液封闭未结合抗原的孔壁，不然这些孔壁就会和后面的抗体结合，然后加入抗体（一抗），抗原抗体结合，这样整个ELISA反应就差不多完成了。如果是直接法，那就是抗体上连接着酶，在加入底物去和酶反应显色，最后形成孔壁-抗原-抗体-酶-底物这个形式。如果是间接法，那就一抗不连接酶，而是加入二抗，二抗上连着酶，形成孔壁-抗原-一抗-二抗-酶-底物这么个形式。如果是夹心法，那就形成一抗-抗原-二抗-酶-底物这个形式。反应完成后，用紫外分光光度计计算光度值，与标准曲线比较，得出抗体浓度值。这里多介绍下一抗、二抗，把抗原注入小鼠体内，抗原对小鼠来说是异物，小鼠体内就会抗体（一抗），再把一抗注入兔子体内，兔子体内就会产生二抗。这样再说竞争法，把抗原分别加入小鼠、兔子体内，产生鼠抗和兔抗，向抗原中加入已知浓度的鼠抗，再向抗原中加入和刚才相同浓度鼠抗和未知浓度兔抗，这样两个抗体竞争和抗原结合，鼠抗浓度减少的部分就是兔抗浓度。

在做ELISA实验时，会有很多影响因素，试剂：一定要放置室温再用，不然弱阳性样本易出现假阴。样本会受到不同影响，如内源性干扰：类风湿因子、补体，外源性干扰：溶血后，血红蛋白含铁血红素，类似过氧化物酶，会造成假阳性，染菌后，菌中含内源性辣根过氧化物酶，造成假阳性。样本保存过久，会造成假阳性。样本反复冻融，会破坏蛋白，造成假阴性。血液样本凝固不全，会造成假阳性。底物需要在用前在配置，注意避光。判读时也应在反应结束后尽快进行。做科研时，选择正确的抗原抗体，找到最好的反应浓度（防止HOOK效应），做IVD试剂盒检测时，建议用全自动设备，减少人为操作误差。反应需一次完成，中间不要暂停，另外注意洗板机是否有孔堵住，造成清洗问题。ELISA法比较成熟，不管做科研还是产品，多查查资料还是很好做的。