液体活检在淋巴瘤中的研究和应用进展

纳兰烙烙

来源：医脉通血液科

液体活检作为一种新兴的非侵入性检测方法，在实体肿瘤的诊断、疗效和预后评价、早期复发和耐药监测等方面发挥着重要的作用。

液体活检的概念

通过检测肿瘤原发或转移部位释放到血液中的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）或其他标记物（如外泌体）对疾病进行诊断和评价的技术称为液体活检。目前多通过检测肿瘤标志性的DNA序列或肿瘤相关RNA 的表达变异进行分析。

CTC指由肿瘤原发或转移部位释放到外周血循环中的游离肿瘤细胞，为包含DNA、RNA和蛋白等的完整细胞结构，比ctDNA能提供更加丰富的肿瘤相关信息。循环游离DNA（cfDNA）指血浆或血清中由健康、炎性和肿瘤组织细胞凋亡或坏死后释放产生的游离DNA 的总和，多以约200bp的双链DNA碎片的形式存在。最新的研究发现通过对cfDNA 的片段谱系进行分析，构制核小体的全基因组图谱，与多种细胞的死亡和生理条件进行对比，可以帮助鉴别cfDNA的组织起源。ctDNA指来源于肿瘤细胞的cfDNA，为cfDNA的一部分。cfDNA或ctDNA在血浆、尿液及其他体液中以多种形式存在，如游离DNA片段、核小体、外泌体、病毒体等，其中外泌体是细胞主动向胞外分泌的一种囊泡样小体，多项研究表明外泌体参与肿瘤的进展和转移。

液体活检的实现基础和应用现状

液体活检是近年来实体肿瘤研究和临床应用中的重要技术进展。早期研究发现，肿瘤患者中平均CTC或ctDNA 的水平高于健康对照，尤其在转移性肿瘤患者中更高。转移性实体瘤外周血中平均CTC的数量为60 ± 6. 93/7. 5 ml。在不同类型和分期的肿瘤中，CTC或ctDNA的水平亦不同。之后研究发现，CTC或ctDNA 携带与原发肿瘤组织中相同的分子异常，为实体肿瘤的监测提供了很好的肿瘤标记物。但长期以来受微量CTC细胞分离和低比例ctDNA基因突变检测技术的限制，实体肿瘤的研究仍主要依赖于组织活检和影像学检查。随着高量基因测序技术的进展和肿瘤基因组研究的深入，越来越多的肿瘤诊断和治疗相关的基因变异被鉴定，并使得从外周血cfDNA中进行全基因组规模的测序分析或检测肿瘤相关的基因突变成为可能很多研究结果表明，液体活检在多种实体瘤的基因分型、疗效评价、复发和耐药监测中具有潜在的应用价值，如研究已明确外周血中CTC数量与转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的无进展生存和总生存相关。

相应的CTC检测系统Cell SeaRch也已被FDA批准用于这3种实体肿瘤的预后评估中。Bettegowda等报道，ctDNA对转移性结肠癌患者KRAS突变的检测灵敏度和特异性分别为87.2%和99.2%，并在96%的EGFR抑制剂治疗失败的患者ctDNA中检测到耐药突变。

液体活检在淋巴瘤中的研究和应用进展

淋巴瘤是一组起源于外周淋巴组织的异质性的恶性血液肿瘤，根据所起源的细胞类型和组织结构的病理变化不同分为多种亚型，其预后因不同细胞起源、病理类型及侵袭性而不同。淋巴瘤虽属于具有组织结构的实体肿瘤，但与其他实体肿瘤相比，具有更易浸润骨髓、肿瘤细胞更易进入外周血循环的特点。除少数肿瘤特异性的基因突变外，目前多数淋巴瘤亚型并没有特异的肿瘤标记物，但理论上绝大多数B或T 细胞淋巴瘤都有特征性的免疫球蛋白（IG）或T细胞受体（TCR）重排序列可作为肿瘤监测的分子指标。因此，液体活检技术在淋巴瘤的辅助诊断和MRD 监测等应用中，具有不同于其他实体肿瘤的特点和优势。

1淋巴瘤中cfDNA 的含量

研究发现不同淋巴瘤亚型中cfDNA 的水平变异较大，其中初诊弥漫大B 细胞淋巴瘤（ DLBCL）、霍奇金淋巴瘤（HL）和套细胞淋巴瘤亚型中cfDNA的浓度显著高于健康对照（中位数12.1 ng /ml），分别为26.9、25.7 和23.1 ng /ml，而滤泡淋巴瘤中cfDNA的水平较低（ 中位14.7 ng /ml）。在另一项儿童初诊淋巴瘤的研究中，同样发现有多种淋巴瘤的cfDNA 浓度（中位46 ng /ml）显著高于健康对照（ 中位1. 6 ng /ml）。不同淋巴瘤分期患者的cfDNA 水平也存在显著差异。Roschewski等报道早期DLBCL患者的中位cfDNA浓度显著低于进展期。

2液体活检在淋巴瘤临床应用中的价值

辅助诊断和基因分型

基于二代测序（NGS）技术，ctDNA检测相关基因变异和IG/TCR克隆性重排序列可用于淋巴瘤患者的基因分型。ScheReR等对初诊DLBCL患者的ctDNA进行268 种相关基因的NGS 测序（CAPP- Seq），结果显示97%（n = 37）的ctDNA样本对原发活检样本中突变的检测特异性为99. 3%，对单核苷酸变异和融合基因的中位重复率大于85%。Rasi等用超深度测序对17例初诊DLBCL患者的cfDNA进行59种相关基因的突变分析，结果显示cfDNA对原发活检样本中突变频率＞ 15% 的基因突变的检测敏感性达到92%。在除DLBCL外的部分其他淋巴瘤亚型中，ctDNA也显示出良好的基因分型作用。

每个B细胞都有其特异的IG重排序列，T细胞有其特异的TCR重排序列。基于此原理， IG/TCR的重排克隆性检测能够在一定程度上指导对B /T细胞克隆性的判断。早期已有研究发现在B细胞肿瘤的血浆或血清DNA 中能检测到IG克隆性重排。ARmand 等报道，在69%（11 /16）的初诊DLBCL和纵膈大B细胞淋巴瘤患者的ctDNA中检测到与原发肿瘤组织中克隆型一致的基因序列。KuRtz等报道，在82%的初治和100%的复发DLBCL患者的cfDNA中检测到与原发肿瘤组织克隆型相同的基因序列。这些研究显示，通过结合NGS技术，ctDNA作为一种IG/TCR克隆重排标记物能够监测原发肿瘤组织中的克隆型，可用于辅助淋巴瘤的诊断和MRD监测。

液体活检在淋巴瘤的基因分型中具有潜在的应用价值，但对不同突变类型的检测灵敏度，以及在不同淋巴瘤亚型中的应用，还需进一步的研究验证。预后和疗效评价多项研究发现cfDNA水平与DLBCL患者的肿瘤负荷、IPI 评分、乳酸脱氢酶水平、疾病进展等相关。KuRtz等通过对ctDNA进行动态监测，发现ctDNA的水平变化与治疗反应相关，并与影像学变化一致，而且能够更早期预测治疗失败。对cfDNA与预后相关性的研究发现，在初诊HL、DLBCL和滤泡淋巴瘤患者中，高水平的cfDNA与预后差相关。而在其他淋巴瘤亚型中，其预后意义未见报道或与不相关。Fontanilles等报道，在原发中枢神经系统的初诊淋巴瘤患者中，cfDNA阳性和阴性患者之间的总生存无显著差异。

预测复发

影像学检查作为淋巴瘤缓解期监测的主要方法，受限于放射性和有限的检测灵敏度，不能有效的早期发现疾病的进展和复发。而与PET /CT相比，ctDNA对预测复发具有更高的特异性。研究发现在完全缓解期的DLBCL患者中，ctDNA监测肿瘤特异性IG 重排序列阳性者较阴性者具有更高的疾病进展风险。Roschewski等报道，在缓解期动态监测ctDNA 能够提前中位3.5个月预测DLBCL复发。ScheReR等报道，ctDNA能对90%（9/10）的DLBCL复发患者提前中位数162天预测复发。

结语

液体活检作为一种非侵入性的检测方法，在实体肿瘤的基因分型、预后和疗效评价等方面均已发挥重要的临床应用价值。而淋巴瘤的组织病理学分型复杂，其诊断一直是困扰病理学家的问题，分子生物学指标的加入将有助于淋巴瘤的更准确分型。淋巴瘤的肿瘤细胞具有更易进入外周循环系统、可通过免疫受体分子多样性标志进行监测的特点，使液体活检具有更为明确的应用意义。淋巴瘤液体活检相关的研究目前尚处于起步阶段，但随着淋巴瘤肿瘤基因组学的研究进展和NGS 技术的推广应用，以肿瘤特异性基因突变和IG/TCR 序列多样性分析为主要内容的液体活检技术将成为辅助淋巴瘤基因分型和疗效监测的重要补充工具。