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[分享] 组织病理的三驾马车

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发表于 2017-9-3 16:20:27 | 显示全部楼层 |阅读模式

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病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术,传统的福尔马林固定,石蜡切片和HE染色技术仍然是病理学的基本技术,大量应用于基础和临床病理学日常工作中,保证和提高常规技术质量和现代设备水平十分重要。正如某院士指出的那样:“病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮,缺一不可,互为依存,互相促进,两者的结合决定着病理学的发展。”
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看看每天的组织切片,它是用福尔马林固定,石蜡包埋的切片,然后HE染色,这三匹马拉着病理这辆车,跑了一百多年,还是这三匹马。一百多年前就是这样,所以可能有人认为一百多年不会变了,就是个古老的分支了。可是在这中间,有人嫌福尔马林有味,用很多的液体代替福尔马林固定,结果呢?都没有成功。还有人用各种方法去包埋,不用石蜡,也没有成功。还有人用各种染料去染切片,最后也没有成功,最后还是HE染色最理想,你说怎么解释呢?像天外来人告诉你的方法,所以没有人能够超越的了。

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一、甲醛固定
    甲醛(Formaldehyde):甲醛为一种无色气体,溶于水成为甲醛水溶液,极易挥发且具有强烈刺激气味,它在水中的饱和量为37~40℅(商品甲醛),甲醛水溶液即市售福尔马林。常用的福尔马林浓度为10℅商品甲醛,此液实际上为4℅甲醛。
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甲醛水溶液渗透力强,固定均匀,对组织收缩较小,多用于大块组织固定,它能使组织硬化并增加组织的弹性。但经乙醇脱水时收缩很大。经它固定的组织,细胞核染色优于细胞质。用10℅甲醛液固定小块组织(1.5×1.5×0.2㎝)数小时即可时间稍长也无关系。随着温度的增高可缩短固定时间。但是,对于长时间固定的标本,需经24~48小时的流水冲洗,否则会影响染色。甲醛水溶液放置日久能产生少量甲酸,使溶液变为酸性,。严重时影响细胞核内嗜碱性物质的染色。因此,在备用的甲醛液中宜放入少量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。甲醛水溶液为无色透明,若逐渐变为浑浊,表示以变性,不宜再用。
甲醛单纯固定液的几个常用配方:
(1)甲醛生理盐水液
37~40℅甲醛液        100ml
氯化钠                8.5g
蒸馏水               至1000ml
(2)中性10℅甲醛液
37~40℅甲醛液       100ml
蒸馏水              900ml
碳酸钙或镁足量
(3)中性缓冲甲醛液(ph7)
37~40℅甲醛液       100ml
蒸馏水       900ml         
碳酸二氢钠   4g            
碳酸氢二钠   6.5g
(4)配制4%多聚甲醛固定液
多聚甲醛                40g
0.1M  PB (PH 7.2–7.4)   1000mL

二、石蜡包埋
浸蜡、包埋的目的
    组织经过脱水、透明后在熔化的石蜡内浸没的过程称浸蜡。包埋是使石蜡变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察的过程。目的是去处组织中的透明剂而代之以石蜡,并浸入组织内部,把软组织变为适当硬度的蜡块,以便切成薄片。

浸蜡的方法
    是将组织块经二甲苯透明后,经数次石蜡,使组织中剩余的透明剂完全去尽。透蜡时间根据组织类型及其大小而定,基本上与组织固定时间正比。通常的实验室常用的石蜡作为透蜡用。常用包埋蜡熔点为52~58℃。
浸蜡过程:一般厚度的实质性器官,总的浸蜡时间2~3小时。
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包埋的方法
    常规石蜡包埋法:在进行石蜡包埋时,先将熔化的石蜡倒人包埋框,尔后用加温的镊子将的浸蜡组织块放人。在石蜡中有杂物时应进行过滤后再使用。防止倒人的石蜡凝固,在包埋时随时熔化凝固的石蜡。包埋时首先注意有无特殊的包埋面(如分层组织,皮肤和内镜活检标本等)。包埋面必须平整,破碎的组织应采集平铺包埋。不要混入杂物。包埋温度不应过高,否则易造成组织块的烫伤,影响诊断。另外,包埋蜡的温度与组织块的温度应接近,不然会引起组织块与周围石蜡的脱裂。包埋一般用为56℃的石蜡,也应根据气温条件作相应调整,以组织块具有合适的硬度,能切出高质量的切片为标准。
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在包埋完毕,蜡块稍凝后,可移入冷水中加速凝固。包埋后要修块。石蜡块可保存10~20年。
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三、HE染色即苏木精—伊红染色
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1、苏木精:从苏木精树心提炼出来。是世界上唯一较好的常规细胞核染色剂。习惯上称苏木精是碱性染料。带正电荷的苏木精的兰色色精和细胞核带负电荷的脱氧核糖核酸吸者而完成染色,细胞核染色成蓝色。
苏木精液的配制方法:
Harris苏木精液:苏木精2.5g,纯乙醇25ml,钾明矾50g,蒸馏水500ml,氧化汞1.25g,冰醋酸20ml。为一般实验室所用。
Mayer苏木精液:苏木精0.5g,蒸馏水500ml,钾明矾25g, 碘酸钠0.1,水合氯醛25g,枸橼酸钠0.5g。染色液需新配制,适用于复染。

2、伊红:是一种胞浆较理想的染色剂。酸性染料组织成分呈弥漫性染色。
0.5%伊红溶液
1)伊红              0.5g
95%乙醇         100mL
2)曙红2.5g
无水乙醇   50ml
蒸馏水    400ml
重铬酸钾  2.5g
饱和苦味酸 50ml
在组织学中所谓嗜酸性及嗜碱性一词,是说该物质易被酸性或碱性染料所染色,而细胞的酸性或碱性正与其相反。

染色的一般程序:
1常规石蜡切片
2脱蜡至水:二甲苯10分×2;无水乙醇5分×3;95%乙醇、85%乙醇,75%乙醇各1分;水洗2~5分。
3染色:(1)苏木精5分钟左右;(2)流水冲洗;(3)分化:75%盐酸乙醇分化或水洗分化。(4)1%氨水反蓝   流水冲洗
4酸性伊红1~3分钟
脱水、透明和封固
结果为细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。
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来源:口腔组织病理

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