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在体外诊断试剂相关产品研发过程中，除了需要关注其准确性和重复性外，研发人员同样需要保证产品在保质期内的品质，因此防腐剂的选择至关重要。防腐剂是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质，在液体试剂中发挥着重要的防腐作用。只有充分了解各种防腐剂的特性，才能选择最合适的防腐剂及试剂配伍比例。 一、防腐剂的作用机理 防腐剂是能够杀灭或抑制微生物，特别是细菌和真菌生长的化学物质。防腐剂不是杀菌剂，没有很强的即时杀灭效果，只有在足够浓度并与微生物直接接触的情况下才能发挥作用。防腐剂通过作用于微生物的细胞膜、细胞壁及酶等多个靶点，破坏细胞的分裂，抑制微生物的生长和繁殖，达到防腐的目的。实际上，防腐剂主要是对酶活力或对细胞原生质部分的遗传微粒结构产生影响的。例如，硫柳汞作用于巯基酶，而庆大霉素则作用于核糖体。总之，防腐剂是通过抑制细胞中基础代谢酶的合成或重要生命物质核酸和蛋白质的合成，起到阻碍细胞生长的作用。 二、防腐剂的一般选择原则 防腐剂的种类很多，如酸碱及其盐类、中性化合物类、汞化合物类、季胺化合物类等。防腐剂对微生物繁殖体有杀灭作用，但对芽孢则使其不能发育为繁殖体而逐渐死亡。不同类型的防腐剂其作用机理也不尽相同，如醇类能使病原微生物蛋白质变性；苯甲苯酸、尼泊金类等则能与病原微生物酶系统结合，竞争其辅酶；阳离子表面活性剂等则是通过降低表面张力作用，增加菌体细胞膜的通透性。 优良的防腐剂应具备以下特性：①加入防腐剂应能有效抑制在试剂盒制备、保存和使用过程中最有可能污染的一种或多种微生物的生长；防腐剂应对大多数细菌、真菌及酵母有较强的抑制作用；②防腐剂在试剂中有足够的溶解度，以保证其在两相或多相体系的试剂中具有足够浓度；③在试剂盒的有效期内，防腐剂应非常稳定，不会因化学降解或挥发而降低浓度；防腐剂本身的理化性质和抗微生物性质应稳定，不易受热和样品pH值的影响，在长期贮存时不分解失效、不挥发，不沉淀，不与包装材料起作用；④防腐剂不与试剂盒中的任何成分发生反应，不会影响试剂盒的检测效果或防腐剂的效果；⑤使用成本低，容易获得。 三、常见的防腐剂 2.1叠氮钠(sodiumazide．NaN3) 叠氮钠是体外诊断试剂中最常用的防腐剂之一，可抑制细菌生长，溶于水、液氨，不溶于乙醚，微溶于乙醇，用量一般为0.1％一0.5％。 多数情况下行之有效，但由于其含有氨基，会干扰辣根过氧化物酶(HRP)、超氧化物歧化酶、触酶等多种酶，所以一般含有HRP的试剂都不建议使用。同理，一般不用于抗体及酶免实验中的标本保存。 另外，它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此也不适用于活体实验。同时，叠氮钠与氰化物相似，属于剧毒化合物，半数致死量为27mg／kg(大鼠，经口)，对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，有显著的降压作用。急性中毒出现头晕、头痛、全身无力、血压下降、心动过缓和昏迷。除对眼和皮肤有刺激性外，还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡，而且遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用时应十分注意安全。出于安全方面的考虑，叠氮钠的使用日益受限。 2.2硫柳汞(thiomersalatum，C9H902HgNaS) 硫柳汞作为防腐剂已有60多年历史，曾广泛用于生物制品中的疫苗及体外诊断试剂。硫柳汞稍有特殊臭味，微有引湿性，遇光易变质，易溶于水、乙醇，不溶于乙醚和苯，用量为0.001％～0.01％。它对革兰阳性和阴性菌均有很强的抑菌能力，为广谱抑菌剂。 其作用机理为重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基结合而使酶失去活性，但对细菌抗原和血清蛋白的损害极其微弱，不能与酸、碘、铝等重金属盐或生物碱配伍。 硫柳汞为含汞化学物质，汞含量占到分子质量的50％，代谢或降解产物为乙基汞和硫代水杨酸盐，乙基汞是由二甲基汞降解的有机汞。由于少量有机汞在理论上具有神经毒性，因此硫柳汞的使用安全问题深受人们关注。 2.3庆大霉素(gentamicin，C21H43N507) 庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的氨基糖苷类抗生素，是由22一脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成的多组分混合物，并以C族复合物为主。其作用机理是直接与30S核糖体亚单位16SrRNA解码区的A部位结合，从而导至菌体死亡。 它的抗菌谱较广，对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用，对革兰阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用。 （梅里埃生产的HIV诊断试剂中提到：对照血清的防腐用0.1g/L硫酸庆大霉素和0.2ml/L肉桂醛。） 但抗生素的缺点是容易产生耐药性，Jakobsen等曾报道了120株对庆大霉素耐药的大肠埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)和耐药机制的关系。 2.4异噻唑啉酮类(isothiaz0linones) 异噻唑啉酮类防腐剂商品化产品主要有Kathon和Proclin，是2种异噻唑啉酮类化合物的混合物，并含有一定量的硝酸镁及氯化镁。此类防腐剂是非常高效的防腐剂，对各种细菌、霉菌、酵母及藻类有很强的抑制作用，使用浓度为0.1％～0.02％(活性成分约为1．5％)。其作用机理为2种活性成分在与细胞膜接触几分钟后，可立即渗透到膜内并抑制细胞内酶的活性，从而抑制细胞生长代谢、大分子合成，引起细胞内能量水平迅速下降；由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物，从而导至菌体死亡。 这类防腐剂能与氯及大多数阴、阳离子及非离子表面活性剂混溶，且在较高的使用浓度下不会影响酶活性。pH适用范围广(pH2～8.5)，化学稳定性好。经实验室检测，在25℃下保存2年，该防腐剂的活性组分仅损失3％，与水可以任意比混合。Proclin系列防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性，是一种理想的可替代硫柳汞、叠氮化钠和庆大霉素的生物防腐剂。 但遇铵、亚硫酸盐、强还原剂和强碱性会降低其活性，在过量使用下有一定的刺激性和致敏性。 四、Proclin系列防腐剂 为解决生物样本处理过程中保存期短的问题，SUPELCO公司（美国Sigma-Aldrich集团下属的子品牌）推出新一代高效生物防腐剂ProClin150，200，300，5000，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。当浓度达到0.02%条件下，ProClin系列防腐剂具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性，因此它是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等生物防腐剂。 1.ProClin 系列防腐剂的优点 广谱抗菌性，作用速度快；良好的与酶的相容性，不会影响与酶或抗体的相关反应。 使用剂量少，6-20ppm的ProClin300即可达到抑菌的目的。 pH适用范围广（pH2-8.5* ）,化学稳定性好。经实验室检测，在25℃下保存2年，该防腐剂的活性组分仅损失3%。 毒性远低于同类产品硫柳汞。 与水可以任意比混合。
2.ProClin 系列防腐剂作用原理 ProClin 系列防腐剂的活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。这两种成分抑制细胞的生长以及促使细胞凋亡的原理相同。活性成分在与细胞膜接触几分钟后，立即可以渗透到膜内并抑制细胞内酶的活性（见图1）。目标酶处于细胞代谢KREBS循环的中心位置，ProClin 系列防腐剂作用KREBS循环的四个不同位置(见图2)：丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)，a -酮戊二酸脱氢酶(ketoglutarate dehydrogenase)，琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)。从而抑制细胞生长代谢，大分子的合成，引起细胞内能量水平迅速下降。由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物。所有的细菌及真菌至少拥有部分KREBS循环，所以ProClin 系列防腐剂的适用的范围非常广泛。其次，ProClin 系列防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性。随着KREBS循环被阻断，细胞产生能量和合成酶等生物活性物质的能力迅速下降，但其使用剂量却保持比较低的水平对人畜无害。 3.ProClin 系列防腐剂性能 （1）ProClin 系列防腐剂对诊断试剂影响 ： 实验数据表明，ProClin 系列防腐剂不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，比如：辣根过氧化酶（HRP），碱性磷酸酶（AP）。 图4. 250ppmProClin300对HRP(AP)与底物结合速率的影响 （2）短期效应 即使ProClin300的使用浓度超过推荐浓度15倍时，其短期内对于HRP和AP的Km和Vmax 无影响（见表1）。 表1.ProClin300对HRP和AP的Vmax的影响 （3）长期效应 长期使用ProClin 300同样不会对酶（例如：HRP和AP，见图5）的活性产生影响。 图5. 4℃(37℃)下ProClin对AP (HRP)活性的影响
（4）ProClin系列防腐剂对抗体结合的影响 在推荐使用浓度下，ProClin 系列防腐剂不会对抗体的结合产生影响。通过研究ProClin 300对经纯化过小鼠IgM抗原与联结HRP的抗-小鼠IgM抗体之间结合的影响，表明浓度在300ppm以下，ProClin 300不会对其产生影响（见图6）。50ppm的ProClin 300保存上述抗体35天同样无影响。 图6. ProClin300对连接HRP的抗体影响 4.ProClin系列防腐剂的参数 5.Sigma官网关于Proclin的介绍 （以上关于Proclin相关信息来源于上海闪晶分子生物科技有限公司和Sigma官方网站） 五、KroVin系列生物防腐剂 1.KroVin系列防腐剂优势 （1）广谱抗菌性 下图为三羧酸循环简图，KroVin系列防腐剂攻击细胞的三羧酸循环中的三个特定酶切位点：α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶以及NADH脱氢酶，并抑制其他酶，例如：丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等，从而抑制细胞代谢，大分子的合成。细胞由于能量体系的崩溃，则无法合成日常代谢所需的化合物。 结论：所有细菌及真菌至少拥有部分三羧酸循环，所以KroVin系列防腐剂的适用范围非常广泛。 （2）良好的相容性 在推荐使用浓度下，将KroVin系列防腐剂分别作用于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶体系，通过对Km和Vmax的测定，KroVin系列防腐剂不影响酶和底物的结合速率，且对酶的活性同样无影响(见下图:Krovin300N对HRP/AP与底物结合速率的影响）。 Krovin300N对HRP/AP与底物结合速率的影响 通过研究KroVin系列防腐剂对经纯化过小鼠IgM抗原与联结HRP的抗-小鼠IgM抗体之间结合的影响，表明其对抗体的结合不会产生影响。 KroVin系列防腐剂稀释至使用浓度后，很容易被生物降解为无毒无污染物质，与各种乳化剂、表面活性剂及蛋白质成分配伍性好。 结论：KroVin系列防腐剂有良好的相容性，不会影响与酶或抗体的相关反应。 （3）其他优势 2.KroVin系列防腐剂功能特点 特点与优点： （1）、广谱、长效的杀灭多种细菌、真菌和酵母菌, 用量低。 （2）、适用的pH范围广泛，兼顾杀菌和抑菌双重效果。 （3）、相容性好，不影响关键酶的活性，不抑制抗体结合。 （4）、与水混溶，可以在任何工序加入，容易操作。 （5）、毒性低，在使用浓度内对健康完全无害。 （6）、无残留，排放不会对环境造成累积污染。 （7）、不燃烧，易于运输，使用方便，使用成本低。 （8）、与各种乳化剂、表面活性剂及蛋白质成份配伍性好。 （9）、性能稳定，无干扰性惰性物质，不干扰ISE电极和试剂的颜色。 该产品pH耐受适用范围广（PH2~9.5），【最佳PH环境3.5-8之间、PH>8时稳定性下降】，化学稳定性好，可与水及阴离子、阳离子、非离子等各种离子型乳化剂，表面活性剂和血清、蛋白质、酶等配伍。主要有以下应用： （1）对照品、包被液、封闭液、稀释液、缓冲液； （2）液相色谱流动相（尤其是糖柱）； （3）校准液（pH等）； （4）洗液和水槽等； （5）体外诊断试剂盒和试剂配制。 KroVin系列防腐剂与其它防腐剂的比较 注1：P**系列为市售著名品牌S**的产品，在体外诊断领域有广泛应用。 KV300/400系列防腐剂具有广谱抗菌活性，能在较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它可降解,对环境友好，又能保持体系中酶的活性，因此它是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等生物防腐剂的产品。 该产品对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。 3.KroVin系列防腐剂列表 有效成分：CMIT: 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮； MIT: 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮 4.KroVin系列防腐剂使用说明 （1）在搬运、使用时不得直接接触，,避免接触皮肤、眼睛和粘膜，一旦与皮肤和眼睛接触立即用大量清水冲洗，不可延误! （2）在运输、贮存、使用过程不可与还原性金属接触，如金属铁、铝等以免导至产品分解。 （以上关于KroVin相关信息来源于西宝生物官方网站）
参考文献及相关信息来源
黄倩云, 吴恩应. 体外诊断试剂防腐剂的选择策略[J]. 生物技术通讯, 2013, 24(4): 592-594 http://www.seebio.cn/Article/KroVin_1.html http://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/biochemicals/biochemical-products.html?TablePage=111264510
来源：体外诊断试剂研发 作者：吉林-免疫-流沙
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雷达卡
发表于 2017-6-23 02:49
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