CTC检测在液体活检中的特殊意义

长长的路

目前，液体活检 (liquid biopsy)正在迅速渗透到医疗领域的各个方面，其特有的便利性、安全性和无创性等特点一举突破了长久以来组织活检的难点，不仅利好广大医学工作者，更为患者带来了福音。肿瘤病人的液体活检主要由检测病人外周血中的ctDNA 及循环肿瘤细胞(CTC)构成，相比而言，CTC在生物活性、肿瘤标示物蛋白表达，以及实时监测肿瘤耐药与复发等方面更具无可替代的特殊意义。

应用美国Cytelligen (赛特生物) 的SE-iFISH检测体系，结合蔡司Metafer-iFISH全自动CTC图像扫描与分析平台，我们与国内外多家医院、院校联合，对多个瘤种的肿瘤病人CTC开展了一系列系统性研究，在如何有效检测CTC及其临床意义与应用方面获得了丰硕成果。最近，由北京协和医院、中国医学科学院基础医学研究所、北京肿瘤医院、解放军301医院、北京大学第一医院等单位与赛特生物联合发表的相关综述(由磊等，2017 临床与实验病理学杂志  33:297)对CTC检测的临床意义及其主要检测方法进行了客观讨论。

如图所示，CTC主要应用于肿瘤的早期检测、疗效(手术、放疗、化疗、靶向等)的快速评估、实时监测肿瘤耐药与复发等。早在2009年1月，北京协和医院肺癌中心与赛特生物(Cytelligen)经过长期临床实验，在全球率先报道了CTC可用于快速评估肺癌病人化疗疗效，并且，CTC的数目在肺癌复发过程中有显著升高(Wu et al., 2009, J Thorac Oncol 4:30-36)。

         CTC 的有效检测主要由两个技术环节构成：捕获及鉴别，也就是人们常说的“抓得着”与“看得见”。分离与鉴别方法的有效性决定着CTC检测的灵敏度与特异性。

   

采用细胞筛过滤法分离CTC会造成小细胞CTC丢失，而这些小细胞具有特殊临床意义，如EMT小细胞CTC（Ito et al., 2014  Intl J Oncol 45:227）。有关过滤法灵敏性较低的客观评价国外已有多篇报道，在此不再赘述。虽然应用EpCAM抗体直接抓取CTC的捕获法 (如CTC芯片，微流控，CellSearch等)已有很多报道，但这类方法最大的局限性在于忽略了肿瘤细胞内在的生物学特性 - EpCAM 表达的高异质性，即不同肿瘤EpCAM表达高低不等，甚至不表达。如下图所示，膀胱癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤细胞的EpCAM表达很低，黑色素瘤（恶黑）不表达。

          目前，一种新颖的不依赖肿瘤表面标示物、不采用低渗溶破法去除红细胞的差相富集技术（Subtraction Enrichment, SE）已被大量临床实验证明，可有效富集源于各种实体瘤的CTC，且获得的具有生物活性的CTC可适于后续的一系列检测，包括原代肿瘤细胞培养等。

         CTC的常见鉴别方法为角蛋白CK染色。然而，EMT导至CTC中的CK降解，势必会造成CTC检测的大量假阴性。有鉴于此，我们与国内外多所院校通力合作，在大量临床样本鉴定的基础上，首次成功地将CTC上的各种肿瘤标示物的荧光染色与染色体倍体检测相结合，形成了全新的iFISH鉴别体系。

         CK、EpCAM具有上皮标示物及肿瘤生物标示物的双标作用，CK或EpCAM蛋白表达的高低、有无与各种肿瘤的进展、分化、转移、耐药等密切相关（其中包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、食道癌、肾细胞癌、鼻咽癌、口腔癌等，详见本综述讨论)。SE-iFISH可专门针对CTC上的多种肿瘤标示物（包括CK, EpCAM, HER2, Vimentin, CD133, CD44等）的蛋白表达进行检测，并结合染色体倍体数目，可精确锁定具有不同临床意义的各种CTC亚类细胞。北京大学肿瘤医院与赛特生物合作完成的临床实验揭示了胃癌病人中不同倍体的CTC具有对顺铂不同的耐药特性 (Li et al., 2014 Oncotarget 5:6594)。此现象也在我们参与的胃癌肺转移mPDX肿瘤动物模型实验中得到了进一步验证 (Jiang et al., 2015 Oncotarget 6:15639)。SE-iFISH 已被证明可有效检测多种肿瘤的CTC。

        免疫治疗是近年来发展极为迅猛的一种新颖的肿瘤治疗手段。最近，已有多个PD-1抑制剂被美国FDA批准应用于临床晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌等的治疗。PD-1抑制剂用于免疫治疗的临床疗效主要取决于肿瘤细胞上的PD-L1的表达量。赛特生物选用国外业内广为接受的PD-L1抗体，率先开发出PD-L1-iFISH检测技术，通过检测肿瘤患者外周血CTC 表面PD-L1蛋白表达，为免疫治疗用药提供准确的客观依据，从而提高药物使用的有效率。相关临床实验已在顺利开展之中。

         为了便于大家对CTC的各种检测方法有一完整的了解，本篇综述将各种CTC的分离与鉴别方法汇总如下：

  

         随着在iFISH CTC 上开展单细胞测序等相关技术的成熟，相信该独特的技术平台会为人们深入了解CTC及开展相关的CTC临床实验与检测提供更大的帮助。

注明：赛特生物拥有中国国家知识产权局颁发的CTC富集 (ZL 2009 1 0137289.0，授权日期2013.01.16) 与iFISH检测 (ZL 2011 1 0340544.9，授权日期 2015.01.07) 两项发明专利，及中国国家商标局颁发的iFISH商标证书 (第10960117号，颁发日期 2013.09.14)。

来源：赛特生物