【体外诊断系列1】之分子诊断技术发展

千姿百态

2.1.1概况

   第一代基因测序技术出现于20 世纪70年代，标志性技术是由 Frederick Sanger和Gilbert等人发明的链终止法和化学降解法。
   如人类基因组计划即是采用第一代测序技术，总共测量了人类基因组中约30亿个碱基对，发现大量与疾病有关的基因，为疾病的诊断与治疗提供了大量信息［1］。 第一代基因测序技术方法简便快捷，但测序通量低，操作过程复杂且费用高，在大样本测序上也存在诸多困难。其具体方法如下：

2.1.2链终止法

1977年，Frederick Sanger[2] 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。人类基因组的测序正是基于该技术完成的。

2.1.2.1原理

Sanger法是利用DNA聚合酶（通常为大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ），以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据核苷酸在某一固定的点开始，利用2'与 3' 不含羟基的双脱氧核苷三磷酸( ddNTP，N可为A,G,C,T任意一种) 进行测序引物延伸反应，ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP），所以在 后续的DNA 合成反应中不能形成磷酸二酯键， DNA合成反应便会终止[3]。在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。在此过程中，通常使用32S进行放射性标记，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而从放射自显影胶片上获得可见的DNA碱基序列，该步骤[4]最为耗时耗力，且降低成本的主要步骤也在此步骤。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）：此酶是最早用于建立Sanger测序的酶。但通常会有两个问题：①Klenow片段的持续合成能力较低，通常只能得到约250~350个核苷酸的序列，而且由于聚合酶随机从模板上解离而终止链延伸，通常会产生较高的本底和假带；②对同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域复制效能低下。但此酶价格便宜，对已知序列的亚克隆进行鉴定仍有应用价值。

单链DNA模版：可以使用噬菌体M13作为单链DNA的克隆载体，并从重组克隆M13mp系列（如mp8、mp9、mp10、mp11等独特的限制性位点）噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板。

  

引物：是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在[url=]核酸[/url]合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

通用引物（universal primer）为十七烷氧基核糖核苷酸，可以与任何重组模版一起使用。

备注：

PAGE：聚丙烯胺凝胶电泳，以聚丙烯胺凝胶作为支持介质，是以单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺聚合而成，这一聚合过程需要自由基催化完成。聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种，前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH 值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH 值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH 值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，本文所涉及的为前者。

聚丙烯胺凝胶电泳的优点如下：

由于是不连续的pH 梯度，故样品被压缩成一条狭窄的区带，因而增强了分离效果，提高电泳分辨率。尤其对小DNA 片段的分析(5～500bp)。在这一范围内，仅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分开。

其次，DNA 纯度很高。从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA 纯度很高以致于下步操作不用任何处理。还有，它的负载容量高。该胶的标准加样槽中可以加入高达10mL 的DNA 样品，而不影响电泳分辨率。多应用于分离纯化和鉴定大小为5～500bp 的DNA 片段。

2.1.2.2 sanger测序法的优势和劣势[5]
1)优势：

金标准：直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。 Sanger 测序仍然是作为基因检测的金标准，也是使用NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
Ø  ‚对于临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。
Ø  ƒSanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行 PCR 直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。

④Sanger 测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测非常经济和高效。

Ø2)劣势：

对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS。
Ø  ‚虽然 Sanger 测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外，可能存在由于酶催化而导至的误差。
Ø  ƒSanger 测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。 且相比于新一代基因测序技术，Sanger测序的成本依旧较高。

2.1.3化学降解法[6,7]

2.1.3.1概述

1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法，其原理为:将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记，再通过5组（也可以是4组）相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。另外，化学降解测序法既可以标记 5'-末端，也可以标记 3'-末端。如果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的 DNA 链序列。

Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差。对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序，其特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者G，C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。

但是，因为有可能在剧烈的反应条件下造成连接体的破坏，所以化学降解测序法的发展延迟了几年。另外检测速度缓慢也限制了其发展，近年，虽然也有不同的改进方法，但总体而言，检测速率仍然缓慢，所以大部分检测仍以sanger测序法为主。

尽管有以上种种缺点，但化学降解法依然是不可缺少的方法。原因如下：

1)遗传信息不仅储存在碱基G，A，T和C的序列，另有少量碱基5甲基胞嘧啶，N-甲基腺嘌呤和其他结构也存储额外的信息并以此来指导细胞分化和基因调控。这些不寻常碱基及其在基因组中的位置只能由未克隆的基因组DNA决定。通过化学测序，印迹和杂交技术或通过化学测序和基于PCR的扩增方案的组合组合来克隆未克隆的基因组DNA。

2)通过化学方法可以容易地研究蛋白质/ DNA内切酶

3)通过化学降解直接测序PCR产物很容易

2.1.3.2优势及劣势

1)优势

在复杂的模版方面，化学测序法比双氧链终止法具有优势。在化学降解法与链终止法问世之初，利用化学降解法进行测序不仅重复性更高，而且由于只需要简单的化学[url=]试剂[/url]和一般的实验条件，易为普通实验室和研究人员所掌握。然而，Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析DNA甲基化修饰情况，还可以通过化学保护及修饰等干扰实验来研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质的相互作用，这些仍然是Maxam-Gilbert法所独具的鲜明特点。

2)劣势

化学降解测序法一般都用32P标记，所以与用32S标记作标记的末端终止法相比，它显示的条带较宽且有扩散现象。这限制了化学降解法在对较大DNA片段测序时的分辨能力。一般一块电泳胶上最多能读出200~250核苷酸序列。

参考文献：

[1]PENNISIE.Genomics:Sequence tells mouse,human genome secrets[J].Science,2002,298.

[2]Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12): 5463-5467

[3]M.J.Owen,DNA Sequence Determination Using Dideoxy Analogs[J].

[4]陈琛，万海粟，周清华；新一代基因测序技术及其在肿瘤研究中的应用[J].中国肺癌杂志，2012，2

[5]基因测序全球地图，火石发布研报，2016年5月

[6]Andre Rosenthal,DNA Sequencing by Chemical Degradation Using One, Two, and Four Different Fluorophores[J].Methods in Molecular B/ology, 1993(23):261-280

[7]DNA Sequencing[/url],[url=]G. Volckaert[/url], [url=]G. Winter[/url], [url=]C. Gaillard[/url] in [url=]Advanced Molecular Genetics[J]. 1984(5)

来源： 医药投资并购俱乐部   作者：于赫