母体血浆游离DNA用于胎儿染色体非整倍产前筛查

青草

这个题目大家最近几年也听的比较多了，是母体血浆游离DNA用于胎儿染色体非整倍产前筛查，这里我们用了一个词是“筛查”，不是诊断。最开始这项技术用于产前检测是用于诊断，但最近几年大家把这个词改变为筛查，最近几年不叫筛查，叫检测。这项技术大概是在1997年，丹尼斯.劳有一篇文章报道，母血清游离DNA发现胎儿的游离核酸，1998年开始香港丹尼斯.劳发表第一篇文章就是用于产前检测方面。非整倍体检查是21三体，之后最近几年，大概2011年和2012年这两年文章出来特别多，基本上有一个非常大的改变。我们需要了解这个技术。虽然卫生局不让在公立医院做这项检测，但是病人知道的比较多，我们虽然不跟她提这项检测，但是病人说我可不可以做无创，尤其是高危的孕妇，所以医生还是需要了解的，不能让病人比我们了解的更多。
    目前我国产前筛查模式采用的是胎儿染色体非整倍体的二级预防模式，所谓二级预防就是早孕期筛查、中孕期筛查。早孕期筛查包括B超NT，还有血清学的标记物PAPP-A和β-HCG，中孕期的筛查是三联的筛查，最近我们国家有的做研究也开始用，加上抑制素A就是四联筛查，所有的筛查结合孕妇一些基本的指标，最终计算得到一个风险值，有一个切割值，高危的孕妇去做有创的产前诊断。
    血清标记物和超声筛查的可信度，结合母亲年龄的三联筛查，对于唐氏综合症，21三体的检出率大概65%-70%，假阳性率控制在5%左右，增加了抑制素A就是四联筛查检出率可以提高至75%，结合母亲年龄NT检测，21三体的检出率可以达到77%，假阳性率控制在5%，结合NT再结合生化指标检出率可以提高到85%-90%，在国外做的更好，他们可以做到90%以上。
    我国产前筛查和诊断技术的行业标准规定了对于三联筛查国家最常用的是三联筛查。规定了假阳性率在5%的前提下检出率希望是达到70%，我国大部分医院最好也就能做到70%，实际是65%-70%之间，对于高危的孕妇，因为我国主要是采用中孕期的筛查，中孕期的产前筛查高危的孕妇主要是做羊膜腔穿刺，对于高龄的孕妇，如果有可能，对于我们国家女性保健法规定对于高危的孕妇还是建议做产前诊断，我们建议在更早的时间11-13周做绒毛活检，查孩子染色体，对于各种原因错过了筛查、或者筛查低危，之后排畸B超发现有问题的我们可以选择做脐静脉的穿刺。
    侵入性产前诊断的利与弊，对于侵入性产前诊断对胎儿进行染色体核型的分析是目前国际上的金标准，虽然最近无创，aray，c-geych是两个热点，但是没有目前的两项检测能够替代产前诊断的金标准，就是核型分析，估计近几年也不回废弃，因为各有各的利弊，金标准有一定流产的风险，大家都知道，这也是孕妇最担心的，e-cord给出的流产的风险大概是1/300-500，这里面说的1%有点高，包括我们医院也没有这么高的比例，它还有一个最大的问题就是报告周期时间长，在国外要求是2周必须给出报告，我们国家可能因为各种各样的原因，各式技术的原因，再就是病人标本量多的问题，可能也得一个月以上，只有少数的医院能在1个月内给出报告。病人拿到高危的筛查报告之后，精神压力非常大。所以她急于想知道结果，这也是个问题。临床诊断不足，能够有侵入性产前诊断的医院并不多，也不能满足所有的高危孕妇进行侵入性产前诊断。
    目前成熟的产前诊断的技术，羊膜腔穿刺、绒毛膜活检、脐静脉穿刺。孕妇最担心的主要问题就是增加流产的风险，尤其是胎儿比较珍贵，IVF、高龄、反复流产好不容易得到一个孩子，在2006年美国做了一个大样本人群的调查，他们对35000例孕妇做了调查，其中只有3000例孕妇同意进行侵入性产前诊断，在这些做产前诊断的孕妇当中大概0.5%会发生流产。
    目前产前诊断技术常用的路线及比较，核型分析是金标准，其他的FISH、QPCR、BoBs、MLPA、MicroArray其实都是一些侵入性的操作，它不是无创的，不是非侵入性的，cffRNA和cffDNA都是无创的，可以抽母亲的外周血，cffRNA存在一个问题，比如它的不稳定性，所以并没有大规模的应用，也就是最近几年cffDNA是无创产前检测，也就是说在二代测序用于临床，其实它是一个转化医学非常好的一个例子，而且用的非常好。现在国内和国际上只报3条染色体，21、18、13，但是事实上很多的公司都能做5条，因为性染色体，总体来说国内和国际得到的结果来说它的阳性预测值、它的敏感性不是特别的高，尤其是21非常高，所以不敢都报出来，其实也是不错的。
   母体外周血含有胎儿游离DNA（cffDNA）原理是什么？丹尼斯.劳1997年发表的一篇文章，发现在母体外周血中含有cffDNA，cffDNA就是胎儿游离的DNA，几乎全部的DNA都来源于胎盘的滋养细胞，它是胎盘来源的，最好可以在怀孕4周检测，一般来说首先得孕周合适，得计算正确，有的时候受孕晚了8周也没检测出来，这是另外一回事。首先孕周准确的情况下，一般来说在7周建立胎盘胎儿循环之后8周它的含量就比较稳定，而且呈一个缓慢上升的趋势，cffDNA片段是比较小的，一般是在75bp-250bp之间，在它的母体中游离DNA含量，在母体血浆中大部分有母体的游离DNA，只有非常少量是胎儿游离DNA，它占的比例大概5%-30%，如果更高的比例可能会提示有其他的一些不良的围产结局。近几年来也有一些国外文献报道了母体外周血中胎儿游离DNA含量异常的增加，可能有不良的结局，包括早产、子痫前期是有关系的。
    胎儿游离DNA是以小片段存在的，它是围绕在核糖体上，经过酶切，因为它正好是核糖体的片段，一个周长，所以片段的长度是非常固定的几个片段，最多见的，含量最多的是166bp这个长度的片段。分娩后母体cffDNA快速降解，这也是丹尼斯.劳在1998年发表的一篇文章，这个发现就是为母血浆cffDNA含量检测，用于产前筛查、产前检测是非常有利的一个证据，一个支持。因为cffDNA半衰期非常短，只有平均16分钟，2小时以后就检测不到了，它跟母血中的胎儿细胞去比，最开始这项无创的非整倍体的产前诊断最开始人们研究了大概十几年，或者是更长的时间，都在研究胎儿母外周血中胎儿的细胞，包括它的分离、负极这些检测，研究了这么多年也不是很好的前景，因为有人已经发现在母血中存在的胎儿细胞，如果生过一个21三体的孕妇，她在几十年死亡后肺里可以找到21三体胎儿细胞，也就是说生过一个不好的孩子，这次怀孕，如果我检测到了，不能说明是这次的，还是上次的，所以这也限制它的使用，但游离DNA是完全不一样的。
胚胎染色体拷贝数变化分析，我们举个例子，它的原理，它是怎么做的。我们假定母体外周血中1000基因组拷贝/ml血浆，大部分是母体的，95%来源于母体，5%是胚胎的，1000个基因组有950是母体基因组，有50个胚胎基因组，对于母体来说，咱们拿一个例子，和11号染色体，21号染色体它的基因组含量，对于母体二倍体都是1900:1900，对于胎儿它的基因组拷贝是100：100，对于3倍体是100:150，总的来说母体外周血浆对于2倍体来说是2000:2000，对于3倍体来说有轻微的增加就是2000:2050，这么小非常轻微的一个变异分辨率需要一个高分辨率的检测才能检测出这么细小的一个差异。也就是检测出2.5%胚胎DNA含量，相当于胚胎基因组比例5%的一半，就是2.5%，二代测序技术可以完全做到的。
    测序技术检测胚胎染色体拷贝数变化。它的流程首先是采集母体外周血浆，通过低速离心，它的离心的方法和我们常规的离心方法是不一样的，提取血浆的DNA，制备测序文库，上机进行二代测序，二代测序是一个随机的，对于游离的DNA的片段进行随机的测序，它只测量36bp的长度，就能明确知道，然后在所有的染色体上做一个定位，知道它来源于几号染色体，仅此而已，这点信息量就够了，这是所有来源于不同染色体DNA的含量在母体外周血中基本上是恒定的，21号染色体基本上就是1.3%左右，非常恒定，如果有轻微的变化，测序技术可以判定出来，也就是在21三体有轻微的增加，我们可以判读。
    计算采用z-scores计算方法。2008年丹尼斯.劳发的一篇文章，它是双盲的，28例21三体病例的母血浆游离DNA检测完了之后，上面的序号1.2.3.4.5这是染色体的编号，所有的这些染色体它的z-scores都是在±3之内。再看21，全是超过了3以上，这28例检测出来全是双盲的，没有告诉这28例有没有正常的，但它通过这个方法全部检测出，也就是说这个方法对于21三体的检测率还是非常好的。
    无创DNA产前筛查临床实验，下面简单介绍一下我们医院，我们医院其实在2011年做了一个前瞻性的研究，这个研究收集了2000多例病例，我们的目的主要是检测无创DNA检测方法对普通人群的13.18.21号染色体和性染色体非整倍体检测的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值进行了一个评价，并简单的做了一个卫生经济学指标评价，它属于前瞻性大规模的临床样本。当时2011年国外发的文章都是高龄孕妇，我们涉及在低龄孕妇，事实上我们这里面混了也有高龄孕妇，当时海淀医院和我们医院两家在收这个标本，这是2011年4月-2011年10月，总共是2200多例标本，一次采集5ml血，当时我们认为采集10ml可能对于结果会更好一点，但是可能病人的依从性上会差一些，我们选择了5ml，而且不补抽血，然后看看5ml是否能够满足临床需要，对于高龄孕妇我们同时都选择了产前诊断，因为所有的常规的人群都去测，高龄我们也收，低危我们也收，对于低龄的孕妇在孕中期做一个平行的母血清学的筛查，就是我们现在用的三联筛查，同时走一个cffDNA的检测，血样是送到贝瑞和康公司检测，筛查阳性和无创病例的阳性我们都是建议它去做一个有创的阳性穿刺做一个产前诊断。我们用一个比较新的Hiseq2000的平台进行的，实验是双盲的，给公司的资料我们只给它样本号，不告诉它这个病人是什么情况。这是实验室的一些质控，基本上都是满足质控标准的。
   简单介绍一下我们的结果，总共收集了2236份标本，都是单胎，有138份样本随访，我们对于所有的孕妇都进行了随访，妊娠结局随访没有数据，所以这个6.2%的标本是替掉的，还有85例样本，占3.8%，无创实验失败，他们大多没有满足QC标准，所以就没有随访数据，这个85例样本其中有75例没有临床数据，所以总共有效的标本是2023例。
    这是孕周的分布，采血的孕周分布平均是在16周左右，最小是11周，最大是21周，91%在15-20周采集血样，年龄的构成，高龄组占14%，大部分是低龄组，占了86%，59.9%是首次妊娠初孕妇，88.6%为初产妇，IVF流产的比例，8.5%比例有自然流产史，其中IVF标本有18例，都是单胎，我们的样本涵盖了少量的IVF病例，我们主要涉及并不是IVF标本，我们只是纳入了一些，然后看能不能检测出来，对于低龄人群，总共是1741份标本，预产年龄是20-34岁，平均29岁，在中孕期筛查高危是249例，阳性率是14.3%，其实稍微高一点，可能有一些孕妇在早孕期做了NT值可能会高，或者是高危的孕妇，也要求做第二次，我们的人群很难控制，所以得到的阳性率还是偏高的，比正常的人群要偏高的。其中21三体高的246例，18三体高危3例，这些人都是在知情同意的基础上进行了产前诊断。产前诊断率是71.5%，其中21三体高危175例，18三体高危3例。  
    无创DNA产前筛查结果，总共收集了是2236例，结果报告是2151例，无创失败率是3.8%，国际报道类似，是3-6%，是可以的。无创检测发现22例阳性，1例T13，6例T18，12例T21，2例XO，1例XXY，总的阳性率1.02%，所有的无创阳性都是在知情同意的基础上进行了产前诊断。
    经产前诊断5种染色体阳性病例总结，所有的核型检测发现阳性病例总共25例，1例T13，5例T18，13例T21，5例XO，1例XXY，综合阳性率1.19%，其中核型发现2例阳性，1例21三体的罗氏易位，还有1例45X嵌核型，嵌核比例是8:2，相对来说还是比较高，我们这2例都是无创检测阳性的。
    这是核型的分析，21.18和13号染色体阳性病例分布特点，高龄人群发病率是比较高的，占2.48%，跟人群的发病率是比较类似的，低龄人群发病率0.63%，占发病人数比例来说，还是高龄低，低龄高，因为低龄人群的基数大。筛查的结果我们做一个比较，筛查中低危里面有5例是染色体阳性，也就是单靠筛查会漏掉5例，包括3例T21，3例T21筛查是会筛出来的，1例T18，T18筛查检出率是85%，还有1例T13，不在筛查的范围之内，无创数据我们发现1例T18是假阳性，这例很有意义，我们当时说服了这位母亲做了母亲核型，这位病人做了穿刺胎儿核型是正常的，我们就对母亲说服她去做了核型，最后发现这个母亲是T18的嵌核型，所以这也是我们T18的假阳性，这个检测没有错，这个比例检测异常存在的，存在不是来源于胎儿，是来源于母亲，所以这也提示我们对于无创检测阳性是一定要做核型诊断的，否则就会把一个错误的孩子去做引产。我们还发现了1例罗氏易位的T21，无创检测阳性，这例病人恰好是IVF病例，无创数据中阳性值是94.74%，三种最常见的常染色体异常，检出率是100%。5种染色体阳性包括了除了18、21、13之外还有加上XY这5中常见染色体的分布，我们按年龄的分布，这是核型的检测，跟3条染色体的检测结果类似，都是高龄人群的发病率高，占总的发病率数比较少的，低龄发病人群低0.86%，但是总的患病者占了65%。这是无创和筛查对比的结果，5种染色体，低龄组13三体，性染色体异常的血清筛查都是低危的，因为它是检测不到的，有9例是漏的，有4例是性染色体，性染色体查不出来，无创数据中也是存在1例T18假阳性，刚才1例，此外还存在XXY染色体假阳性，假阳性率是0.1%，无创数据中阳性的预测值是90%，无创数据中我们漏了2例45X，其中有1例嵌核型，嵌核比例比较低，还有1例是XXY样本，总的检出率是86%，也就是说，其实我们把性染色体加进去之后，总的阳性预测值会有降低，主要是由于对性染色体的检测率没有那么强，不像常染色体这3条，目前为什么国际上只报这3条，在美国有的公司为了降低成本，它只报21，或者是第二年有2篇文章出来，它是定位在哪个片段上去做一个测序，这样可以降低成本，它那个是保阳不保阴，也就是阳性的我认为预测值还有，阴性的他就不一定。其实我们重点是怕漏，所以我们更在乎阴性里面有没有漏掉的病例。
    综合来说5种染色体的检测指标，13、18、21它的灵敏度都很高，它的特异性也都很高，其实就是性染色体差一些，可能是因为性染色体本身的特点造成的，国外做了一些对性染色体的检出率，几万例她们结果的数据，认为性染色体可能不到70%，我们国家做出染色体检测率的灵敏度也就是70%。这就是无创检测目前存在的问题。简单介绍一下我们失败样本的特点，失败样本刚才说了有85%，其中包含1例45X，还有1例T21，这个失败样本中阳性病例的数跟国外研究报道中失败样本中的比例还是想近的，我们主要是因为DNA的抽提失败，也就是目前我们后续的检测把采血量增加到10毫升，失败样本比例就会降低了。
    无创DNA产前检测技术用于产前筛查存在着较大优势，检测的假阳性率在0.05%-0.1%，跟目前血清的筛查相比是差的太远，有利于大大减少不必要的侵入性产前诊断，这也是它的一个优势，也就是目前人们看中这项检测的前景的一个亮点，不仅是缓解目前产前诊断所面临巨大的压力，更重要的是不必要的减少了介入性产前诊断的操作，检测的漏诊率还是比较低的，0%-13%，所以这项检测可以进一步提高我们国家出生缺陷的防治水平，它可以覆盖13号染色体还有性染色体，虽然对染色体的检测不像常染色体希望的那么理想，但是毕竟可以检测，虽然有一定的假阳性率，但是报出来还是提示我们应该重视一定要做一个诊断，13号染色体它的阳性预测值还是比较乐观的，所以对于这两类染色体异常的检测对于目前血清筛查不能做到的，在实验室水平是很容易控制的，没有年龄的依赖，不像我们血清值筛查，年龄算错了，不一样的，孕周算错了，所有的危险值也不一样，没有这样的依赖，但是首先你得确认孕周，目前国际上做的都是在11-12周之后才去抽血，在早孕期8-12周我们在做目前结果比较理想，如果确实是8周检测是没有问题的，它可以覆盖IVF人群，其实这是我们初步的一个结果，但是我们没有对大样本的IVF人群去做检测，我们只是包含了18例IVF人群，我们这项研究的结论是希望它能够在将来在早孕期、在低危人群做一个无创的DNA检测，我们还得了解它的不足之处，这项检测非常好，在国外把它定义为筛查，给的评价就是近乎于产前诊断的筛查，这是我们医生必须得了解，近乎于产前诊断不等于产前诊断，它的精确度非常高，它的阳性率非常高，但是有非常低的假阴性的比率和假阳性的比率，所以说这项检测非常好，也许将来非常有前景，国内目前需要走一个程序，需要在公立医院大规模的开始用，也需要更多的研究来支持，比方这个检测存在什么问题，存在一些不足之处怎么去解决，我们怎么跟病人咨询这是我们需要去了解的，不是说这项好，你就去做没问题，阳性肯定是，阴性绝对没问题，千万不能这么和病人说。
    我想强调测序不能解决所有的问题，病人说，我是不是做测序就没事了，你千万不能和她说你做测序没事就没事，因为测序不能解决所有的问题，目前包括国际上和国内给的正式的报告都是只做3条的，21,18,13，性染色体都不报的，发现性染色体他们会告诉你，建议你去做诊断，但是没有发现不等于你没有，因为有可能会漏，但是阳性也不一定就一定有问题，我们这里8假阳性其实就是个例子，所以我们一定要做后续的产前诊断。血浆操作的问题，我们有1例病人是14周采样，当时是因为QC失败导致抽提失败，没有往下做，其实这例是T21，后来我们就改了CF管，专用的一个管子，这个管子可以保存几天都没有问题，这就导致了以前EDPA管子的弊病，那个管子需要在6小时内处理，如果不处理的话就会有白细胞的破裂导致DNA抽提的失败。还有双胎和嵌合体的问题，双胎前两天我们请了丹尼斯他给我们做了，其实双胎不是说不能测，我们对双胎做无创产前诊断要确定它的核子性，如果是单卵双胎，其实她的意义跟单胎检测是一样的，双卵双胎它的意义可能就会打一个折扣，它敏感性就会降低，所以说不是双胎一定能做或一定不能做这么简单的事情，一定要区分它的核子性，而且核子性做B超是希望在早孕的晚期或是8-14周给一个核子性的判断，有的病人这个时候没有做B超，有的B超检测不是100%的准确，所以这也是问题。
    最近2011年和2012年大量的文章出来之后，美国的A-cord给了一个Committee opinion，从他们的国家具体的情况给了一个建议，它的定位是在高危孕妇，可以提供一个cffDNA的检测，它的检出率是98%，假阳性率是﹤0.5%，是非常低的，它认为cffDNA的检测不应常规用于产前实验室的检测，但是经过初步筛查的高危孕妇咨询时你可以给它提供一种选择，为什么他们一定是做在高危人群，首先经济上是一方面，这个检测设出来是为了检测而不是从钱的考虑，经济是一方面，美国这方面做一线筛查和二线筛查，高危的孕妇我们才去做无创，它定位在高危还有他们一线的检出率比我们做得好，他们做早孕期筛查，做四联期筛查，他们都比我们检出率好，我们自己的筛查会更担心低危人群会漏，cffDNA的检测这三条染色体和2个性染色体这5条染色体其实最常见，我们cffDNA目前只报3条，我们跟病人咨询的时候一个技巧，筛查高危T21的，这项检测对于T21的预测值可能到99%以上，你不是可能就把握度很大，不是T21，但是如果产前筛查报T21阳性，T21高危，其实只有50%的几率是T21，还有50%的几率是别的问题，比方说不良的围产结局，不良的早产，比方说子痫前期，这也就是说目前在争论这个无创能不能用于一线筛查，因为现在的筛查模式能被无创来替代，也就是说血清学筛查也有些好处，无创做不到，无创目前有很多研究，就是它对于外周血胎儿游离DNA的含量的改变，其实也提示一些不良的围产结局及预测，其实也许会有更多的研究出来之后可能会弥补这些不足，人们可能会认为无创做不到的像血清学筛查的那点好处。目前数据并不是很多，他认为不应该用于低危人群或双胎、多胎无创的非整倍体检测，主要是缺乏一些数据，将来前景还是不错的，我们咨询非常重要，你应该告诉他这是一个什么样的检测，它的利是什么，它的弊是什么，它的阳性结果代表什么，阴性结果代表什么，一定要跟孕妇讲清楚，现在网络很发达，孕妇从网上知道这项检测，而且有的孕妇说这项检测非常好，你看我不能做羊穿了，其实不是这么简单，不能说做了它就不用做羊穿，得跟病人说她的风险是在哪，病人得完全知情同意，得完全知道这项检测，否则将来漏掉1例，我漏掉了是你的责任是不行，我们千万不要把话说那么绝，这些我刚才也都已经讲过了，也就是他的检测阳性和阴性的结果意义，尤其是阳性病例，尤其是无创阳性一定要跟后续的诊断，还要强调一点，目前国内国际还认为cff-DNA的检测它不能代替融穿或者羊穿产前诊断，他筛查也好，检测也好毕竟不是一个诊断。
    现在筛查的阳性预测值不到0.5%，也就是说做100个高危孕妇，做羊穿可能不到1%。不到1个是有问题的，这项检测如果做得好，技术能够控制的很好，可以把99挑出来，这样就非常好，这也是这项技术非常有前景的一方面，谢谢大家！