胶体金标记技术（制备方法和应用）

笑看风云

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。

用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971 年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。

近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从 90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。

一、制备方法

在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。

但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。

1、Frens标准方法：

（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL.

（2）约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，

（3）继续煮沸约5分钟后结束反应。

（4）冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。

（5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。

该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。

2、Slot标准方法：

（1）取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，

（2）再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。

（3）将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色，

（4）冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm.

胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的胶体金比大颗粒胶体金能吸附更多的银离子，而且小颗粒胶体金比大颗粒胶体金更为稳定。所以，在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒更为稳定。所以在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒也较小。据Holgate称，免疫金银染色法的灵敏度甚至比Sternberger的PAP法还要高出很多。该方法一度存在的主要问题在于背景染色过高，但1984年，Springgall等通过修改物理显影操作程序，已基本解决这个问题。固相免疫胶体金标记技术出现较晚，其原理与液相标记一样。所不同的只是通过不同的方法最终将胶体金标记物吸附于固相支持物表面，近而进行检测。常用的固相免疫胶体金标记技术有胶体金免疫层析法和胶体金免疫渗滤法。胶体金免疫层析法是根据层析原理，将胶体金标记的抗原或抗体固定在层析用固相支持物上，通过层析作用，使抗原与抗体专一性结合。胶体金免疫渗滤法是让抗原与胶体金标记过的抗体分别滤过有一定孔径的膜（常用NC膜），在此过程中抗原与抗体专一性结合，未专一性结合的抗体滤过膜。两种方法都最终通过胶体金聚集产生的颜色变化作为结果判断的依据。为了减少胶体金用量，常常通过银染加强显色。

二、应用

免疫胶体金技术可以快速，灵敏检测特定蛋白，这种技术避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且，检测结果可以长期保存，便于对照分析。使检测更具有普遍性。免疫胶体金标记技术作为一种日臻完善的检测技术，已被广泛的应用于众多的科研领域中。本实验采用斑点免疫金—银染色法（Dot-Immuno- Gold-Silver Straining Method，Dot-IGSS），利用NC膜可以与带负电荷的蛋白质产生较强的疏水作用，从而使目标蛋白与NC膜产生较强亲和力的特性，以及NC膜易于被封闭的特点，使用NC膜作为固相载体。先使被FMDV免疫过的牛血清（含FMDV抗体蛋白）与NC膜结合，然后使用合适的封闭液将NC 膜未结合蛋白的位点封闭，再用胶体金标记过的抗FMDV抗体蛋白的二抗与FMDV免疫过的牛血清作用（利用抗原抗体的特异性结合反应），将未特异性结合的蛋白用PBN溶液和DDW洗脱。最后，利用胶体金可以与银离子产生电荷吸引，通过银染加强显色效果（胶体金本身呈淡红色，银染后呈蓝黑色），使得可以通过肉眼直接观察结果。本方法具有简便快速，灵敏度高，可直接用肉眼判断结果，无须特殊的设备的优点。

三、影响因素

1、 标记时pH对标记的影响。

根据标记物的性质，可以将标记物划分为三类。

其一为pH非依赖型，即标记时无论pH如何，您都能得到良好的标记结果，前提是您不能破坏胶体金的胶体状态。此类标记物仅仅是通过疏水相互作用与胶体金相结合，如P EG.这也是调节pH时首先要采用PEG保护电极的原因，当然，如果您使用的是充胶的电极，那您就不必这样麻烦了。呵呵，真希望所有的标记物都象P EG那样简单。

其二为pH非严格依赖型，即标记时您可以采用的pH范围比较宽。此类标记物的特点是其等电点的范围很宽。当然，其主要是通过碱性氨基酸残基的正电性与胶体金的负电性相吸引，此类物质典型的如H BsAg.如果您想偷懒的话，制备好胶体金后，您可以直接将HBsAg扔到里面，就能得到良好的标记结果。不偷懒的话，您当然可以调节pH啦，这样，标记的批间差可能小一些，P H从5到10都可以。呵呵，俺们也很喜欢这样听话乖巧的东东。

其三为pH严格依赖型，即最好的标记效果是pH=pI+0.5.这样的东东可是大家最最常见的，再此就不饶舌。

2、 标记物与胶体金结合后的稳定性

一般来说，pH非依赖型&pH非严格依赖型的东东标记后因pH的变化而解离的几率不是很大，尤其是pH非依赖型。当然前提仍然是您不能让那些东东处于极其苛刻的p H环境之下的，还是要爱护它们的。

pH严格依赖型的东东根据对环境pH的变化有可以分成两类，第一类是结合后如果环境的pH高于其等电点，标记物很容易与胶体金解离。如果您再加入盐，您会看到胶体金会变成紫塞- 蓝色。此类标记物静电相互作用要大于疏水相互作用，其分子量一般相对小。（这也是DOA中为啥不标记完全抗原的原因之一）。因此，其胶体金稀释液的p H要与标记时的一致，其它缓冲体系最好也如此。第二类是结合后如果环境的pH高于其等电点，标记物一般不会与胶体金解离（啥，您要试试p H 14的？！ ）。如果您加入盐，胶体金仍然能保持一颗红心不变的。此类标记物疏水相互作用/配位键>静电斥力，其分子量一般比较大，如抗体。当然，缓冲体系就比较好办了。

3、 标记物的量

按照常规的方法，最低稳定量+10-20%是好的，但俺们认为您最好做一下功能性实验（灵敏度，稳定性），可能您会发现再多加一些蛋白，如抗体，其灵敏度和稳定性会更好一些。这是因为在浓度高的情况下标记，抗体倾向与利用F c片段与胶体金结合，这样就有较多Fab片段处于游离状态。就如在拥挤的情况下，人也会尽量将脖子伸的更长。

4、 标记物与胶体金结合的三个力

众所周知，标记物是通过三个作用力与胶体金相结合的，一是静电引力，二是疏水相互作用，三是配位键。对蛋白而言，调节标记pH的主要目的是使其包含在内部的疏水性氨基酸残基暴露，而不是刻意使蛋白带正点荷。在p H=pI+0.5的条件下，蛋白整体上是呈负电性的，只是其碱性氨基酸残基为正电性。俺们认为，在最适的标记条件下，如果标记物的硫原子很少，对大分子而言，结合力是以疏水作用为主的；对小分子而言，结合力是可能是静电引力为主，也可能以疏水作用为主的；如果标记物的硫原子很多，那肯定的配位键是主角，因为配位键的作用力最N 了。配位键就想一个聪明而有调皮的小孩，让人即爱又恨。爱的是您可以利用它来牢牢固定一些难标记的物质，如某些分子量小，疏水性氨基酸残基少的蛋白，这几乎相当与共价结合了。如通过巯基化，您还可以将一些小分子的抗原与胶体金标记。另外，通过加入巯基化的封闭剂，您可以大大增加胶体金结合物的稳定性。哈哈，有的采用此方法封闭，胶体金结合物在两年内活性几乎没有下降。恨的是万一您标记物中的硫原子过多，它又很容易在胶体金之间起到桥联的作用，而使胶体金相互凝集。在一些情况下，即使您将标记的p H调节到12以上，胶体金仍然会凝集的。

最后一点，标记物是结合在胶体金二十面体的棱角上的，而不是棱角上所围成的面上，可能与我们想象的有一点点差异。