胶体金免疫层析诊断试纸(lateral-flow)试验结果分析方法

笑看风云 · 发表于 2013-6-21 23:56

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近日有许多朋友询问胶体金试纸如何记录和分析试验结果，每次试验面对的都是使用肉眼判断条带颜色深浅，不同的人对结果的判断都不相同，容易出现误判，平行试验结果无法对比。且试验结果无法直接记录，不能留下有说服力的试验结果证明，就这个问题，我将谈我的一些看法。以下讨论仅针对普通胶体金试纸，荧光，化学发光，磁粒子等特殊标记物必然需要读条仪器。

一、现状

很多学术论文中对胶体金试验的结果记录通常是罗列简单的阴性(-)阳性(+)来表示。对于实验结果，很少有人提供T线吸收色度值，甚至图片来说明。严格的说，这些论文的真实性，可信性都很难让人信服。同时，在做产品的时候，QC检测中如何去判断产品是否合格，简单的-，+也不能很好的说明产品质量。有一些厂家也推出了商品化的胶体金结果读条仪，包括BIODOT的TSR3000读条仪，国产读条仪和其他自制的读条系统。然而这些仪器又有多大作用，是否能真正快速的解决我们所遇到的问题呢?

二、原理

要分析试纸实验结果，首先需要了解试验结果的获取过程。

在试纸条的T线位置，通常是由于免疫反应出现胶体金标记物的滞留，出现深红色条带。我们所观察到的是可视信号。同一个条带的颜色在不同的位置可能有深有浅，还会有中空，泛白，鬼线等干扰现象。同时由于NC膜，标记物释放，点样过程等等问题。在NC膜表面残留了或多或少的金溶液残留信号，对我们需要的信号产生干扰。

测试不同浓度的样本，T线的颜色深浅度可能不同。且需要在做实验过程中进行比较。

不同的处理样品垫配方，处理T线溶液配方，胶体金溶液配方可能有不同的颜色深度。且需要在做实验时候进行比较。

在做老化存放实验时，不同时间做的测试可能有不同的颜色深度，且需要在实验过程中进行比较。

判读结果的时间一般是滴加样品后3分钟或者5分钟。(以下用3分钟情况为举例说明。)

那么从以上分析可知我们的需求。在滴加样品后，3分钟，需要读取可见信号，并要对付一定的干扰。同时要将这个信号转化为可比较的数字信号。

三、实践

1、色卡法

如何实现用肉眼快速判别，又有一定标准，那么色卡法将是一个很好的选择。该方法投入资金量非常小，且能够建立一个简易的判别标准。实际操作情况如下。

所需资源，标准颜色比较卡一本(印刷行业使用，廉价，仅用于颜色选定可以考虑借用)，彩色打印机(为保证色彩还原性好，可以考虑到附近的照片打印店制作)，相片打印纸若干。已经反应过的胶体金试纸条，需要强阳性，弱阳性和阴性。

制作步骤：

(1)选色，将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡比较，选出合适的颜色，注意不同的反应浓度颜色梯度使用的标准色不同，梯度越多则做出来的色卡越准确，一般是设置出0-9档， 0为全阴性，9为强阳性，中间梯度递增。

(2)将选出的颜色打印到选好的相片纸上，相片纸的背景色最好和膜的颜色保持一致，不要过白。打印的图形应该和胶体金试纸的点样线条一致。即从左到右，上C下T,4mm/每段线条，线条间隔>4mm,共10组(0-9档)。打印后一定要做覆膜否则颜色非常容易掉。(3)在每档的上方都标明档次，方便比对读数。(4)如果要求比较高，可以以该打印色卡装配到成型的胶体金试纸条内，仿真程度则极高。使用步骤，将反应好的试纸条T线颜色与制作的色卡比较，看颜色属于那一个档次，则在数据记录时候填写该档次标识。最后做灵敏度比较。该方法的优点在于使用方便，为肉眼判别设定了比较标准，能转化为档次数据。缺点在于人眼对颜色的敏感性差异较大，同一个试纸T线不同的人可能会归类到不一样的档次标准上。数据还是人眼判读，不适合做为数据证据。于是出现了更好的图形扫描法。2、图形扫描法该方法使用的资源非常容易解决，普通的扫描仪器就能够胜任。且能对最后结果做精确的数据分析。需要的资源，普通扫描仪，能扫描灰度图象即可。能对灰度线条图象进行读数的软件，试纸条的反应线条和薄层层析的线条实际上是很相似的，所以软件也可以借用那个领域成熟的产品，有很多例如bandscan,都是免费的。使用步骤：将反应好的试纸条放在扫描仪器内，选择灰度扫描，获得灰度线条图象。然后打开分析软件，将该灰度图象导入，自动分析出峰条带(=可以看出是否有前后带效应)，峰面积(=灵敏度)，本底情况(=跑板是否干净)，根据峰面积数值做平行线性分析，就能知道实验的重复性和获得回归曲线。该方法的优点在于可以把反应信号数据化，并可以作为实验证据做发表。缺点是操作复杂一些，同时软件方面现在只能用很多其他领域用的版本，没有专门针对胶体金试纸版本，不是很方便。如果有哪位懂编程知识，我可以与你合作开发这个方面的共享软件，已方便大家使用。3、读条仪法很多厂家都开发了对应的读条仪，大部分都是采用简单的30万象素数码摄像头做一个拍摄，然后用软件分析。做得好的如进口的使用的是 cool ccd,干扰少一些，效果好一些，当然价格也贵，意义不大。做得差的如国产的读条仪用电脑城卖的普通民用数码摄像头，80块一个的成本，对外销售价格惊人，且还不如用扫描仪来得效果好。以上是通用读条仪，也有生产厂家为自己的试纸产品专门定做的读条仪，那是针对其特定产品使用的，一般不兼容其他试纸，所以不做讨论。