在免疫层析试剂中，应用在膜上的蛋白的首要作用就是作为样品中目标分析物的检测试剂。由于检测结果完全地依靠检测试剂在膜上达到良好的固定效果，所以完成蛋白固定的高且一致水平的重要性不言而喻。自从NC膜首次被用于蛋白固定以来，尽管以NC膜为基础的研究大量的进行过，但是结合的确定机理仍然不知道。比较为人所知的作用力有疏水相互作用力、H键、静电相互作用力等，但是对确定作用力的理解和各作用力的贡献还不是很清楚。目前主要有两种假说：第一种认为蛋白质与膜的开始结合由静电相互作用产生，然后依靠他们之间的H键和疏水相互作用来维持它们间长时间的结合。虽然很难证明这种假说，但是这个模型拟合发表的试验数据，通常被模型所接受。 以上两种假说尽管都有实验数据支持，但是实验也表明，任何能够影响疏水相互作用、H键、静电相互作用的因素，都将影响到蛋白质与膜的结合。第二种认为蛋白质与膜的开始结合由疏水相互作用产生，而它们间长时间的结合由静电相互作用来完成。这种模型也能和很多发表的数据一致。然而静电机制对用干燥或乙醇固定步骤来固定蛋白的现象不能给出很好的解释。不管蛋白固定的结合力是如何平衡的，产品开发者在寻求蛋白固定的优化条件时，应该要考虑所有这些作用力。这些考虑包括使用材料的选择和加工它们的方法。例如，产品开发者选择了一种明显降低疏水作用和静电作用 的缓冲液，蛋白固定的水平可能会急剧下降。同样，普遍认为蛋白应用后对膜足够的干燥，对确保蛋白－膜之间长期稳定性是重要的步骤。如果膜上蛋白质的量不足或者膜与蛋白质不能很好地结合，将会出现一些重要的问题。从捕获线的试验结果上我们可以清楚地看到这些现象（如图2）。如果膜上的蛋白质量偏低，捕获线将偏弱并且灵敏度也会降低（如图3）。如果蛋白质失效，蛋白质在膜上固定以前将会发生扩散，捕获线将变得宽而弱，这会结果变得难以说明问题。举一个极端的例子，如果说膜上蛋白质的物理吸附能力足够弱，那么分析蛋白质和表面活性溶液通过膜时将会冲走其上面的反应物，实验结果将产生一条很弱的线或者说根本就是一条模糊的线，这样的试验结果很难说明问题（见图4）在研究蛋白检测试剂固定在NC膜上时，产品开发者应当承认以下五个方面，可能会影响条带的机制：
- 溶解检测试剂的缓冲液。
- 检测试剂作用的膜。
- 检测试剂本身。
- 用于蛋白质与膜结合的系统。
- 蛋白使用时的环境湿度。
虽然很多开发实验室在学习和描述用于它们试剂的缓冲液和膜方面做的很好，但是他们还是不大可能全部研究或优化他们用到的检测试剂和应用系统。这些忽略通常是因为后者在开发之前就经常被考虑到，在开发中很少有机会被改变。由于那些忽略的因素，产品开发者往往没有机会并集中优化在他们考虑范围 内的其他因素。
捕获试剂
用来作为捕获线的蛋白因为不同的测试目的而必须相应的变化。无论他们之间差异如何微妙，没有一种蛋白质会与另一种蛋白质完全一样的。更重要的是，不同的蛋白质在不同的膜上的结合水平有很大的差异。因此，在优化过程中，最好是直接用单克隆抗体（如果测抗原），这里蛋白是均一性物质。而用多克隆抗体主要问题是它们有不同的抗原决定基，各种抗原决定基的抗体与膜的最佳结合条件都有细微的差别，这样就增加了优化的难度。IgA、IgM这些分子由于结构或位阻问题，优化的过程会面临更大的挑战。而象BSA、Protein A、Protein G等大分子蛋白质由于它们的化学性质及分子量的缘故，调节它们与膜的结合特性就更加困难（分子量越大，蛋白质越易吸附到固相材料上）。
环境湿度 环境湿度条件对点膜过程非常重要，它会严重影响C、T线的质量，特别在喷膜系统在使用过程中。如果空气湿度太低，静电荷容易聚集在膜上，这时点膜就容易产生斑点；而这时测试，膜上就容易产生疏水斑。相反，空气湿度太高，膜上的毛细作用加强，这时点膜就容易引起C、T线变宽甚至扩散。一般来说，最佳的环境湿度应保持在45~65%RH。而且，为了保证所有要用的膜材料有均一的特性，点膜前应把膜放到工作环境平衡一段时间。最佳的平衡时间应由实验来确定。因为作为捕获线的检测试剂都不一样，优化给定蛋白固定的缓冲液是不同于其他蛋白的。通过改变所用的缓冲液，需要优化的两个重要因素是：
确保足够的蛋白被用到检测线上，首先检测蛋白要溶于应用缓冲液中。因为要保证有效的蛋白质溶解度，溶液里就要有一定的离子强度；但是离子强度高了，正负离子又会干扰蛋白质与膜的相互结合。因此，最重要的一点是如何决定一个尽可能低的离子强度溶液而又能保证足够有效的蛋白质溶解在缓冲液里。如果蛋白质在给定的浓度下物理特性稳定，则它将趋向于溶解在溶液里。但是若它的能量状态有利于形成固相，那么吸附到膜上的蛋白比稳定溶解在溶液里的多。这种能量状态可以通过加入去稳定剂和沉淀剂来形成，然而，如果这类试剂的作用过量了，也会产生一些其它的问题。例如，若蛋白在用到膜上之前就发生沉淀，那么整个试剂系统就高度不稳定且几乎完全不可再生，可用来吸附到膜上的溶解蛋白的量就因此急剧下降。且溶液中的沉淀也可引起如堵塞使用中的设备及闭塞膜上的微孔等现象。有些情况下为了获得一合适吸附水平的蛋白浓度，在生产中或许有必要使蛋白质沉淀。这些对一般规律来说是例外的。 从以上的分析表明，蛋白质与膜的结合能力可以通过调整它所处的缓冲系统的特性改变，关键的是缓冲液的离子强度、pH值及所用沉淀剂的水平。
离子强度 在一定范围内，一般蛋白质的溶解性将随着溶液离子强度升高而增大，为了使溶液中的蛋白质分子的稳定性降至最低，因此，溶液中应保持尽可能低的离子强度。这样的话使蛋白质与膜的吸附固定的速度上升。开发者也应注意到高盐浓度也会引起蛋白质的沉淀，而且在点样后膜在干燥时，大量盐的存在将干扰测试的灵敏度和稳定性。
酸度 缓冲液的pH 值对蛋白质的特性有极大的影响。一般来说，蛋白质的溶解性在它等电点时是最低的。因此开发者为了尽可能的降低溶液中的蛋白质分子的稳定性，缓冲液中最理想的PH 值应控制在所用的蛋白质的等电点附近。
共沉淀试剂 在调整缓冲液时，为降低溶液中蛋白质分子的稳定性，开发者可以选择加入去稳定试剂沉淀剂。加入沉淀剂的作用是依赖于IgG分子的Fc与Fab片段对加入的试剂有不同的稳定性，这就是在沉淀剂的作用下，Fc片段的稳定性下降远远快于Fab片段，Fc片段的部分去稳定作用导致了更多的疏水基因的暴露，在正常情况下这些疏水基是隐藏在蛋白质分子内部的。因此，不管哪种蛋白质与NC膜结合的机制起作用，因为沉淀剂作用引起的疏水性增强都将提高蛋白质的结合能力。 过去最常用的沉淀剂是有机醇，因为有许多理由值得推荐。有机醇的存在能帮助湿润NC膜，减少膜可能带有的静电，并且对溶液中的蛋白质有去稳定作用。在用膜作为免疫分析中，加入3-5%的甲醇能极大地提高它的性能。 几年前就已经知道，在ELISA实验中，使用乙醇来提高蛋白质一固相的结合性能，而现在这已经成为标准方法了。脂肪醇对NC膜结合蛋白的影响首先是在1980年知道的，当时，在profeim blotting 实验加1% 异丙醇 作为固定剂在广泛的使用。尽管一些物质如硫酸铵等有时作为沉淀剂也有很好的效果，但是它们通常不如有机醇，这些类型的试剂中，甚至是微小浓度的变化都会严惩影响蛋白质的沉淀程度，正因如此，一般情况下，多用有机醇而不用其它物质作为沉淀剂。 综合以上各主要点显示，一般情况下，新产品的开发都是以下组合的缓冲液开始的： 10mmol 磷酸缓冲液+3%甲醇+PH7 尽管这种缓冲液并不是对所有的蛋白质都是最佳，但是它提供了一个开发过程极好的起始点．
膜对蛋白质的结合有显著的影响 影响膜的特性的关键因素有： 不同类型的膜对同一种蛋白质的结合水平存在着很大的差异，这就意味着任何一个新产品的开发都必须重新筛选膜。 膜的孔径和膜的后处理均可独立地对蛋白质的结合水平产生显著的影响。图5现示了免疫球蛋白和白蛋白对于不同孔径规格及不同厂家的膜的结合水平的比较。从一系列的数据也显示蛋白质结合水平的变化与膜的标示孔径变化之间的关系不大。从图中比较也可显示对于免疫球蛋白有最佳结合的膜不一定对白蛋白也有最佳的结合能力。因此，相关蛋白的结合水平既受膜的规格的影响，也受膜的来源的影响。 对于有固定表面积的一系列膜来说，蛋白质的结合水平是由生产膜的聚合物的类型及影响膜表面活性的处理试剂共同影响的结果，膜产品的基本聚合物都来自许多商业可用的来源，但每一个来源在特性上都有轻微的不同，而且，不同的膜生产厂家对膜都有不同的处理方法。对产品开发来说，总是建议通过实验来评价相关蛋白与他们即将打算使用的膜的结合特性。 产品开发者可用厂家标示的孔径来区分不同的膜，但应注意仅限对同一个生产厂家的产品而言。因而不推荐用标示的孔径来区别不同的厂家生产的膜材料。一般来说，标示的孔径没有一套标准方法来确定蛋白质的结合量，特别是在lateral-flow分析中，因此，开发者在开发一个新产品时，建议最好筛选一下膜的孔径范围。对于任何范围内的NC膜，膜结合蛋白质的量都将随着孔径的减小而上升，这是因为膜上实际可用的表面积增大的缘故。 对于每一种不同孔径的膜，它大约的表面积可通过看表面积比率来确定。（SAR估算出来，SAR代表该孔径的膜实际可用的表面积与所用膜平面积的比率 <见表Ⅰ>）。还有一主要的现象是，随膜孔径的减小，膜层析率也将变小<见表Ⅱ>,层析速度减小将提高检测的灵敏度,因为被测试剂将在捕获线停留更长的时间。 综合以上两种现象可以看出，使用膜的孔径越小，可得到的相对灵敏度就越高．因此，作为总的指导方针，若开发者最关心的是分析的最终灵敏度，那么就应选择尽可能小孔径的膜；若开发者道德考虑的是分析的速度，那么就应该选择较大孔径的膜。总之，无论需要的是什么，对开发者来说，在产品开发的早期，通一等系列的实验评价，他们总能找到一种最佳孔径的膜． NC膜的生产的一个例行过程是膜的后处理，目的是去掉膜表面的没有聚合的小分子前体或者修饰膜的重湿润性能。在另外的一些情况下，通过这样一些的后处理过程，也可引入一些膜本身没有的痕量物质或者别的一些物质，以改良测试分析的最终结果。 在一般情况下，生产者应该知道在膜上需加附加一些什么物质，它们的浓度是多少以及怎样来测量它们的浓度水平。通过这些附加上的物质的作用，可以看到它们对蛋白质与膜结合的水平的影响，膜的层析速率以及对膜的寿命的影响。 在大规模的工业生产中，为保持NC膜的显润特性，膜的后处理通常来用一些实践的经验，但是，对于膜在到达客户手里之前及在试剂盒生产中点样T线后，是否进行后处理，仍然存在争论。从商家买来已经处理过的膜可能是一种很好的选择，因为这样的话就可减少试剂盒生产者额外的工作量。这些经处理过膜可以直接拿来到生产中使用，因此，这样就节约了生产设备和生产成本以及生产过程所用的时间。当然，产品开发者在决定是否接受这种已处理过的膜之前，应该考虑到以下一些能引起某些应用中不合适的问题。 NC膜在点样捕获线之前进行后处理的一个主要缺点是湿润剂在膜上会移动可漏去，若膜被长期贮存后这种现象将更为明显。膜上湿润剂浓度的改变会影响蛋白质与膜的结合特性，当然也会影响湿润特性及层析速率。这样，产品的货架寿命将取决于用于膜的湿润剂的浓度、实际产品的可能有效期及产品在使用中某些可能的未知因素。另一方面，若生产者在购买后在内部做膜的后处理工作，那么，应记录好膜上湿润的试剂浓度及做好它们在膜上老化的研究工作。这样开发者就能够创建一个适当的后处理程序来确保膜的使用和长时间保存。 未处理过的NC膜，其亲水性是与它的孔径直接相关。 对于未处理的NC膜，它的亲水性是其孔径结构的直接功能。但是经过亲水性试剂处理过的膜，其亲水特性就由其后处理试剂来决定了。如果膜在贮存过程中发生后处理试剂漂移或者在测试时被样本冲走，那么膜的实际特性与它原有的特性将相比将发生很大的变化。在原始的QC检验中，能使生产者判断亲水性后处理和孔径结构所引起的对膜的复杂影响。但是若后处理试剂老化或者膜的特性发生改变，从而使得膜的特性取决于膜的结构的程度上升了，则原始的QC检验就无效了。若生产中不同批号产品使用的膜孔径结构一致，而且未经亲水试剂处理过，则能确保产品的可变性更小减小。 因为许多后处理试剂都是水溶性的，当捕获线被测试时，任何水的存在均可把捕获线区域上的后处理试剂冲走。结果导致膜上部分位置没有湿润剂，因而高度疏水，使得被点在捕获线上的试剂接近不了被测样品中的目标试剂和金标，这将严重影响试剂盒的可读性。常常有这样的情况出现：疏水导致样品不均一通过捕获线，使捕获线结果产生条纹或显色深浅不一致。更有甚者，还在捕获线上出现反白现象。如果在点样捕获线后进行后处理，就可避免这些缺点。 产品开发者在权衡是否使用已经后处理的原料来保持一致性还是用没有包含表面活性处理的原料来保持稳定性，应该从时间及成本方面来考虑。
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