美国液体活检行业综述

长长的路

癌症液体活检正吸引着大量的资金和注意力。它能否实现引发肿瘤学领域变革的愿景？想象一下，未来有一天，癌症诊断可以通过一次简单的抽血实现。这一极具诱惑力的想法正吸引着越来越多的商业巨头。在今年年初，Illumina公司宣布，它正在成立Grail公司，一家总部位于旧金山的癌症筛检公司，其已由诸如Amazon的Jeff Bezos和Microsoft的Bill Gates这样的高级投资人注资超过1亿美金。西海岸沿线，Pathway Genomics已经发布了针对癌症“风险增加”的群体的九个癌症驱动基因的血液循环肿瘤DNA（ctDNA）检测。而Guardant Health已经宣布打算在今年年底发布它的多臂、多站点伞状试验——LUNAR的初步数据，该试验结合ctDNA，影像学检查，并使用其他技术对诊断为早期癌症的患者或有患癌风险的健康人的血液进行检测。

也有不同的声音说，对于健康人，这类癌症筛查检测仍然显得华而不实 ——或者更糟，弊大于益——除非该技术可以在灵敏度和选择性方面做出改善。Walter Koch，位于加州普莱森顿的罗氏医疗诊断的全球研发主管说，“实现那些早期检测将是非常具有挑战性的....我担心我们还没有足够的临床数据支持这些我们希望拥有的机遇”。

接下来，我们来谈谈这个领域的发展现状。

寻找癌细胞

组织活检，用于癌症诊断的金标准，也不是没有缺点：它们是侵入性的，痛苦的，并对一些癌症来说是很难甚至不可能的事，且常有副作用或感染的风险。在许多情况下，肿瘤是异质的，活检并不总能提供足够的组织来给出肿瘤突变的范围和潜在病理机制的全貌，特别是当一个恶性肿瘤已经发展到转移阶段。更重要的是，来自肿瘤活检的信息只能在单一时间单一部位给出一个肿瘤的快照。治疗（或一次转移）后，原来的活检可能就会过时，不能准确反映肿瘤演进的新的基因构成。

与此相反，液体活检，这种基于血液的检测的吸引力在于，它们可提供一个疾病进展过程中连续观察患者肿瘤状态的窗口。血液检测可以跟踪肿瘤对抗癌药物出现耐药的过程，揭示残余病变的存在或提醒肿瘤学家肿瘤的复发。最终，如果临床医生能够对这样的检测结果给出有针对性地搭配抗癌疗法，也许晚期癌症可能会成为可管理的慢性疾病，就像今天的HIV，Guardant Health的CEO——Helmy Eltoukhy——如是说。

研究人员从几十年前开始就已经知道，肿瘤脱落的细胞和凋亡的癌细胞脱落的DNA片段会进入血液。活的癌细胞也会脱落含有包括DNA，RNA和蛋白质等细胞物质的囊泡，被称为外泌体（exosome）。根据圣地亚哥Epic Sciences的首席执行官Murali Prahalad所说，尽管外来体的数量微乎其微，甚至少至十亿血细胞中仅有一个，但循环肿瘤细胞（CTC）被认为是转移性癌症的关键模式，他们正在开发基于CTC的液体活检检测。“随着时间的推移，转移部位是由这些细胞建立的，转移部位本身开始脱落细胞进入血液循环并驱动癌症进展” ，他说。

外泌体——脱落自活细胞的包含亲本细胞DNA、RNA和蛋白质的脂质膜泡——的诊断潜力是2008年位于马萨诸塞州剑桥的Exosome Diagnostics公司创办的动力。该公司已经在市场上推出了肺癌和前列腺癌检测，并且正在开发其他癌种。外泌体的一个优点是它们在血液中比CTC更普遍。据该公司的首席战略官Johan Skog称，他们正在开发结合外泌体RNA和ctDNA的方法以增加检测信号。 “绝对没有理由只看ctDNA，这是浪费信息”，他说。此外，来自MD Anderson癌症中心的Raghu Kalluri最近成立了一个新公司，Codiak, 该公司正在开发外泌体诊断和药物递送的应用。

表：在临床上使用的液体选择活检平台

使用抗体抵抗像EpCAM这样的单一标记是不理想的。非上皮来源的或那些已经摆脱EpCAM的癌症往往会逃逸。作为替代方案，波士顿哈佛医学院的Mehmet Toner采取了另一种策略。Toner认为，与其大海捞针，不如拆了草垛，让CTC无所遁形。他的研究小组与来自马萨诸塞州总医院的Daniel Haber合作，一直在强生公司的支持下开发微流体的方法。他们的设备根据大小和免疫排序消除了血小板以及红细胞和白细胞，留下少量的细胞，它们的分析显示这些细胞中包含了CTC。

其他公司正在利用癌细胞不同寻常的性质来将它们从典型的血细胞中分离出来。Vortex Biosciences公司位于加利福尼亚州门洛帕克，他们的微流体装置有专门的通道用于捕获较大的肿瘤细胞，同时允许较小的血细胞通过。Steve Crouse，该公司的首席商务官表示，他们希望在2017年第一季度将他们的芯片推向市场。在休斯敦，ApoCell利益细胞的介电性能，这是膜结构的一个功能，从其他血细胞中分离癌细胞。

Epic Sciences也试图采用结合细胞形态，蛋白质生物标志物分析和专有算法标记潜在的CTC的成像平台捕获到更多的CTC。利用这些信息，他们已经开发出能找出那些响应靶向治疗的CTC的检测，他们正在与生物制药的合作伙伴合作设计能够帮助药物开发的检测项目，Prahalad说。该公司已经开发出一种临床前列腺癌检测产品，Epic AR-V7，其检测雄激素受体的一个位于细胞核的翻译变异，该变异赋予抗雄激素药物，诸如Janssen Biotech的Zytiga（醋酸阿比特龙）和Medivation / Astellas Pharma的Xtandi（恩扎鲁胺）的耐药性。该检测将通过一项与Genomic Health公司达成的协议在美国实现商业化。

探索循环DNA

分离CTC提供了在筛查时多次检测同一样品的机会。但是，从筛查的角度来看，除了细胞，临床液体活检还有一种更简单和更可靠的路径。由于肿瘤细胞死亡，它们的DNA消化残余几百个碱基对到血液中。在这些序列中发现的突变可以帮助研究人员拼制肿瘤细胞的遗传图谱。来自ctDNA的材料更丰富， Eltoukhy指出，他的公司Guardant360检测用的是来自ctDNA的 70个已知癌症基因的数字测序panel。

John Heymach，在休斯敦MD Anderson的一位临床研究员，对CTC和ctDNA都有研究，但他认为最终ctDNA在常规临床应用方面具有优势。因为它不一定需要新鲜的样品，并且更适用于高通量的方法。此外，ctDNA省时省力，不需要专业知识就能获得结果，他说。（Heymach和Guardant Health有伙伴关系，并曾在ApoCell工作。）

Guardant360 检测于2014年早期就已市售，主要看四种突变类型：单核苷酸变体、拷贝数变异、融合和插入/缺失。这只是一些公司寻求用下一代测序策略或PCR识别ctDNA中关键基因突变的产品之一。Illumina公司支持的Grail公司正在推行类似的策略，即一个用于早期癌症检测的ctDNA的多基因panel兼具特异度和灵敏度，来自纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的科学顾问委员会的会长José Baselga说 “，这将是既有广度也有深度的测序”。

今年五月，Foundation Medicine（Roche是其合作伙伴和最大股东，持股57％）推出了液体活检平台，FoundationAct，该平台通过基于杂交捕获的二代测序检测62个相关基因和涉及6个基因的融合。四月份在新奥尔良举办的美国癌症研究协会年度会议（AACR）上，他们给出了该平台对各种癌症的400个样本的数据进行分析验证的结果，显示出98％的敏感性。也就是说，如果患者有一个DNA变异大于他们的检测限（1/1000），那么该变异被检测到的概率是98％，根据该公司的首席战略官 Phil Stephens所言。公司目前拥有的200肺腺癌患者的数据显示与活检（未处理过的）保持超过94％的一致性。

不过，Stephens指出，即使金标准福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检也有其局限性。他们发现四分之一表皮生长因子受体突变的患者和三分之一间变性淋巴瘤激酶基因融合的患者会被现有的检测遗漏掉。他说这一点显示了FFPE诊断是如何难以执行以及，它跟ctDNA相比更有挑战性。因为相比ctDNA，FFPE需要更大的肿瘤组织切片。

肿瘤液体活检试水

到目前为止，液体活检大多数研究都集中在晚期和转移性肿瘤。此类患者通常有数百克的肿瘤，而与之相比，早期癌症患者只有不超过几克的肿瘤， Heymach指出。释放到血液中的细胞和核酸的绝对数量使得检测更加容易，如下图所示。

图：并非所有癌症的检测灵敏度都是一样的

来自约翰霍普金斯医学院的Diaz和合作者的数据说明ctDNA在不同级别的转移性癌症患者中被检测到的可能性取决于肿瘤的类型。

因此，灵敏度仍然是一个关键问题。与此相反，试验的特异性非常高。“如果液体活检检测到某突变，那么该突变很有可能就在那里” ，Heymach指出。但是也有一个需要警惕的地方：组织活检和液体活检检测肿瘤时不一定得到相同的结果。组织活检，ctDNA和CTC DNA的一致性研究表明，不同类型活检检测到的突变发生率相似，但每种方法不一定检测到相同的突变。有重叠，但不是100％，Baselga指出。

其中的一些差异可能来自肿瘤活检和抽血之间的时间滞后。在6月份美国临床肿瘤协会的年度会议上，Guardant报告了一项包含大于15000例晚期癌症患者的研究。在来自近400个样本的匹配的组织和血液（ctDNA）中发现的突变的总体准确率是87％；当两者收集时间差在6个月内时，准确率达到98％。但是一项阴性的液体活检检测并不能排除癌症的存在，可能对某些类型肿瘤来说不是最佳选择。在这项Guardant研究中大于15％的晚期癌症患者的血液中ctDNA水平未达检测限。然而，该队列包括胶质母细胞瘤患者，他们的血脑屏障可以防止ctDNA到达外周血，降低了检测的灵敏度，据Guardant称。

这个领域正在剥丝抽茧，约翰斯·霍普金斯大学的教授兼PersonalGenome Diagnostics的联合创始人Victor Velculescu说。“我认为该领域正在从中学习，坦率地说，没有完美的分析”。虽然肿瘤活检可能永远是重要的，他认为液体活检会作为一种非侵入性地跟踪肿瘤发展的方式被突显，这是组织活检做不到的。

对于Foundation Medicine的Stephens，广泛基因检测的着力点在于没有治疗方案的晚期癌症患者。“如果医生采取现成的化疗疗法，我们从文献中知道成功的可能性是很低的，或者就是我们做一个基因组谱，并设法找到有针对性的治疗或免疫疗法”，他试探性地说。

并非所有人都认为在液体活检与肿瘤活检之间观察到结果差异就要否定新的检测。据Baselga称，虽然与肿瘤活检相比有误差，偏差和时间滞后，但他质疑这些金标准检测是否真实地代表了肿瘤在治疗时的生物真相。相反，他希望看到检查血液ctDNA水平和治疗反应之间的直接关系的研究，而不是将ctDNA与并不完善的肿瘤活检相比较。

对治疗的指导意义

检测生物标志物只是其中一个液体活检难题，据Heymach称，更难的问题是知道该怎么用这些信息。许多遗传标记可以预测复发，但是，这并不一定改变治疗。“结果取决于很多东西，最重要的是新疗法的有效性”，Janssen Diagnostics的首席医疗官JorgeVillacian说。

去年十二月在圣地亚哥乳腺癌研讨会上Baselga和他的同事们展示了液体活检如何可以在不久的将来开始指导治疗。BELLE-2试验研究的是在雌激素受体阳性的晚期乳腺癌患者中Buparlisib对磷酸肌醇3激酶（PI3K）途径的影响，Baselga的团队使用液体活检在血液中寻找突变的PI3K（PIK3CA）催化亚基，他们在587例患者中找到200例。Buparlisib和抗雌激素药物FASLODEX（氟维司群）的组合疗法显著改善那些有突变的患者的无进展生存期，与单独接受FASLODEX治疗的3.2个月相比，提高到了7个月。ctDNA突变的存在，Baselga指出，“是改善的最佳预测” 。然而，那些肿瘤活检有PI3K突变的患者使用联合疗法却没有得到相同程度的改善，这说明揭开生物的复杂性仍然极富挑战性。

纽约Memorial Sloan KetteringCancer Center一项包括193例患者的前瞻性试验的研究小组用EpicScience的CTC检测雄激素受体变异7（AR-V7），AR-V7被认为是转移性前列腺肿瘤抵抗雄激素受体信号传导抑制剂的一种生物标志物。该数据显示，有AR-V7的患者预后较差，但对紫杉烷化疗如Zytiga和Xtandi的反应比对雄激素受体信号传导抑制剂的反应好。

Pathway Genomics首席医疗官Glenn Braunstein说，患者的疗效是一个关键问题。“如果我们或任何其他公司做的ctDNA检测真正有用，那么我们应该看到患者治疗效果的整体改善”。一些观察长期结果的试验目前正在进行。位于加利福尼亚州的Cynvenio已推出了一项跟踪已诊断三阴性乳腺癌的女性并根据ctDNA检测观察复发迹象的癌症试点监测研究。PathwayGenomics目前正在为一项跟踪期设计为5年的临床试验招募患者。Braunstein希望随访期更长的大型试验获得更多的支持。

同时，诊断巨鳄Roche已经成为液体活检领域中的一个重要玩家，他们在去年收购了拥有CAPP-Seq技术的CAPP Medical公司。但此前，他们主要是在研发基于单基因PCR的方法。 今年夏天，该公司的第一款液体活检产品cobas EGFR变异检测v2试剂盒，成功地通过美国FDA的批准。这款基于PCR的试剂盒，最初被批准为伴随诊断，用于鉴定有EGRF突变的患者对于Genentech的癌症药物Tarceva治疗的有效性。现在，这款试剂盒还被用于鉴定另外的EGFR突变，预测患者对AstraZeneca的第二个代生成抑制剂Tagrisso的反应。

早期检测的愿景

液体活检在晚期恶性肿瘤诊治中的广泛运用仍然面临许多障碍。但这相比早期癌症检测——液体活检领域的终极目标——来说不值一提。只要看看现有的癌症筛查技术——前列腺癌的前列腺特异性抗原（PSA）检测，乳腺癌的乳腺X线摄影和肺癌的CT扫描——就可以了解到在一般人群中实现液体活检的早期癌症筛查有多么不确定和困难。

早期检测可能会导至不必要的压力。这可能会导至对可能不存在或不会造成危害的潜在疾病的干预。或者它可能只是意味着患者较早地被诊断，但并不会延长寿命，这是一种称为时间偏差的现象。“这些早期检测方法有多么有用或强大还没有被完全了解”，Velculescu说。例如，如果医生在液体活检筛查时发现了什么，他们不一定知道下一步该怎么做，因为检测没有告诉他们潜在的肿瘤在哪。

Pathway Genomics的 Braunstein承认，在早期阶段使用这些检测可能会给患者“安全的错觉” 。他们的检测目前在一期癌症患者身上的突变发现率是17％，而四期癌症患者的ctDNA的突变发现率超过50％，他说。“在我们的临床试验中，我们确实试图强调低水平的阳性结果并不意味着患者有癌症，而阴性结果并不意味着病人没有癌症”，他补充道，“临床医生应知道如何使用这种类型的数据” 。可能会确保一个低水平的阳性结果在三个月内重复验血，或跟进影像学检查或其它筛查。他预计，ctDNA可能会面临和PSA筛查类似的挑战。“我们正在开拓一个新的领域，这是毫无疑问的”，他补充道。

Guardant的LUNAR项目预计在今年的下半年得到初步数据，初期目标是实现早期肿瘤的检测，随后的目标是检测能确实地改善预后。该公司在四月AACR会议上展示了它的2阶段大肠癌数据。“这是一个小的研究，但我们有约86％的灵敏度和99％的特异度”，Eltoukhy说。LUNAR使用的是新版本的更敏感的技术，据Guardant说。

一些液体活检的限制可能会取决于肿瘤和生物标记。“我相信我们越往早期测，就越会看到不同类型癌症导至的临床灵敏度差异”，Guardant的Eltoukhy说。“你会开始触到生物标志物的检测限，并越来越明显”。灵敏度在晚期脑癌中下降，他指出，“我认为我们将开始看到早期癌症的分叉”。

“如果你在你的无细胞DNA中发现异常，你会不知道是什么意思。我们知道，良性病变[良性痣和非浸润性乳腺癌]会包含看起来像是驱动变异的东西”，加州大学圣地亚哥分校Moores癌症中心的RazelleKurzrock说。但另一方面，Kurzrock称这项技术是变革性的，并在2016年共同创办了位于圣地亚哥的CureMatch公司，旨在以液体活检推进精准医疗。

早期检测做不到100％。在I期或II期癌症中，更可能会做到30-40％的水平，美国约翰霍普金斯医学院的LuisDiaz预计，他也是Personal GenomeDiagnostics的共同创始人。即使检测仅检出一半的患者，那也可能会占每年所有癌症诊断的20％，他指出。

要去识别早期癌症的一个论据是识别到的局部肿瘤通过手术就可以切除，Diaz说。靶向治疗，虽然对于疾病管理很重要，但并不适用于所有类型的肿瘤。“三分之二的癌症，你只需要切除就行了”， Diaz说，“大概是单独靶向治疗的一半以上” 。

尽管面临这些挑战，大多数研究人员依然看好液体活检应用于早期检测的前景。Velculescu说，“我认为这不是几十年的事情....我们将开始看到人们利用这一方法来识别某种肿瘤的高风险个体” 。

文章编译自Nature Biotechnology

来源：云健康基因