我如何qPCR数据分析？

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我叫林平之，这次是我作为实验室的老鸟，第一次给你们讲qPCR的那些事情。最近做得比较多，所以也有了点点心得哈。

为了分析qPCR数据，呃，我也是蛮拼的，下载了好多qPCR的分析软件，什么LinRegPCR、Markergaul、qCalculator、pyQPCR。

结果发现，这些软件，对我来说，都没什么卵用。比如这个pyQPCR，打开是这样的：

要输入qPCR中导出的TXT文件，但因为这个软件挺老的，很多新机型的文件都识别不了，就是基本上不能用。

LinRegPCR挺好，可以打开，但打开后，我发现，这个软件是用来具体分析阈值线范围的，也就是推测qPCR线性期的软件：

PCR扩增的时候，有基线期，指数期，线性期和平台期，每个时期的扩增效率不同，当然指数期的扩增效率最高。这个软件是通过扩增曲线上每个点的扩增效率情况，选取最均一位置划阈值线。最后就导出CT值：

但我只是要一个数据计算的软件，所以这个也用不上……

Markergaul是个网页版的，但我根本打不开。qCalculator可以计算，但格式是以标准曲线为主的一种绝对定量：

我还是没解决我的问题啊，师姐，咋办？

莫愁：给你一款我用的qPCR计算小软件哈。叫“Real Data Analysis”，为啥叫这名字呢？呃，是我自己起的……

主要是根据这篇文献：Pfaffl MW: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucl Acids Res 2001, 29(9):e45中的计算方法来做的。

大概的意思是这样的，在做qPCR之前，我们先要进行一个标准曲线的计算。为啥呢？其实我们之前也讲过了 ，通过标准曲线，可以计算出针对某个引物的扩增效率，因为引物间的扩增效率不同，所以会导至计算上的问题。一般如果用2-ΔΔCT来计算的话呢，其实就是把目的基因和内参基因的扩增效率都已经假设为2了（也就是每轮产物倍增）。

正确的qPCR，是需要在每次引物扩增前进行引物扩增效率实验的，也就是将模板进行稀释，分成5个梯度，然后扩增，计算每个梯度的CT值，画标准曲线，计算出PCR扩增效率。

用我的这个“ReａlDａtａAnａlysｉs”，首先在相应的Sheet上分别分析内参基因和目的基因的引物扩增效率：

在黄色区域填入数据就行了，模板里是我瞎写的数据，可以看到，这组瞎写的数据是以三倍来稀释cDNA的，所得到的扩增效率是1.6878，根本没有到2。

在两个标准曲线都计算完毕之后，可以去进行表达计算了：

一样，也是在黄色区域填入数据，由于是扩增效率的-ΔΔCT法计算，这张表会引用之前计算出的扩增效率来进行计算，公式在右上角哈。

当然，为了有时候偷懒，我还做了最后一个Sheet，也就是用2-ΔΔCT法计算的，假设扩增效率都是2的效果。

好了，拿去用吧！

…华丽丽的分割线…

李莫愁博士：qPCR数据分析其实大家都有自己的方法吧，最次最次，就是用qPCR仪的软件本身来计算。这个就是个小软件，让大家自己来分析一下qPCR结果的。要注意的是，其实引物合成后，扩增效率的计算其实理论上来说是必不可少的，这个有时候也会很大程度上影响你后期的实验结果。

好了，今天就先策到这里吧。

来源：实验万事屋

黄先生

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