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开头语：一日，小白遇见正在挖蜜蜂的隆地熊，便问道：“熊哥，羊博士叫我去做逆转录PCR，可是我第一次接触根本就不知道如何设计引物，更别说开展实验。听百度哥说，你挖过那么多蜂蜜，见多识广，应该能帮个忙吧？”说完，眼里似乎含着泪水，一脸萌样望着肥嘟嘟的隆地熊。其实，在小白刚说前半句时，隆地熊就想打断它：“很容易嘛，问百度哥呀，它肚子里多得是。”可回过头一想，百度哥虽然信息丰富，但鱼龙混杂、不成系统，会让小白很为难的。因此，隆地熊决定开一篇有关如何设计PCR引物的文章送给萌小白。
号主按：如何设计PCR引物？这是个硬命题，答案自然是(1).......(2).......(3).....巴拉巴拉一大堆。如果还是这么写，估计小白又要流眼泪了。于是乎，号主特地提醒隆地熊，注意更换形式，要声情并茂的，语言要接地气的，能让隔壁读小学的小明也能看懂的。当然，对于这种要求，隆地熊常常是拒绝的，“我都是免费给你供稿，还这么多要求。哼！”
“如何设计PCR引物”看到这个题目后肯定有问“什么是PCR”的。对于这个问题，连小白都知道，您不知道，就只好去找百度哥咯。虽然百度哥肚子里其他的信息乱七八糟的，但是这个问题的答案还是蛮统一的，不会有误导性，但问无妨。另外，也可以看看下图老外给的简介，英文不好请有道。
跟“服装设计”类似，设计PCR引物也需要工具的。因此，在做设计之前，先翻翻自己的电脑是否有“primer premier”或者“Oligo“之类的引物设计专用软件。当然，这些软件都是破解版的。说到这，先喊下口号“支持正版，打击盗版！”。如果您恰巧没有，也不用急，请留下邮箱地址，我会悄悄发送给你。做PCR无非两种目的：一是用于病原体检测；二是用于生 物学研究，如克隆、测序等。根据目的不同，PCR引物设计的流程略有不同。
首先来讲讲如何设计PCR引物用于病原体检测，这也是分子诊断常涉及的问题之一。对病原体的检测，保证检测特异性是关键。因此，在做设计之前，先得找特异性核酸序列。这些序列要相对保守，即突变率低。如小白要做的逆转录PCR——一类以RNA为目的序列的PCR，就得找RNA对应的cDNA（互补DNA，可问百度哥）保守序列来做引物设计。类似地，找保守序列也要用工具的，熊哥常用“Vector NTI Advance”里的“AlignX"模块。当然，您也可以选择相对简单的DNAman软件来做比对。如果您恰巧还是没有这个软件，没关系，请留下邮箱地址吧。好了，下面开始第一个手把手演示——如何用AlignX来做序列比对。
手把手演示1：用AlignX做序列比对。本次演示以查找手足口病毒EV71的衣壳蛋白VP1基因保守序列为例。
2. 在“Nucletide”空白栏里输入关键词，本实例输入“Human enterovirus 71 VP1 gene”，然后在右侧“Results by taxon”栏里选择“Enterovirus A71”。
3.你会发现有7174条相关序列。一般系统默认每页只显示20条，当然可以设置显示数为最大的每页200条。
4.这时可以点击“Send to”在Choose Destination界面中选择“Clipboard”会将前500条序列加入Clipboard。
点击右上角的“Clipboard: 500 items”，就意味着已经选择了7174条中的500条，而这500条也是最新上传的核酸序列。
再点击“Send to”在Choose Destination界面中选择“File”，在format下选择"FASTA"，点击“Create File”，会将前500条序列下载下来。
5.打开“AlignX”，点击导入数据按钮，选择刚才下载下来的FASTA格式文件，即可导入序列。
然后进行序列筛选，剔除那些过短的序列。本例中，完整的VP1基因有八百多bp，故低于八百的全剔除。
全选余下序列，点击比对按钮，即可进行比对。 特别说明：如果想让保守序列更加准确，比对序列的数量越多越好。当然，此时得考虑小白的电脑能不能承受，如果想Note7一样发生自燃了，不要怪隆地熊哦。哈哈！
比对完后的结果是这样的： 到此，小白要设计的PCR引物序列其3'大部分序列最好在这些黄色区域内，再也不用担心漏检了。当然，要保证特异性，还得进入第二个手把手演示了，如何利用保守序列设计PCR引物并验证其特异性。
号主按：写到此，隆地熊觉得题目太大，如果一篇下来，小白读起来肯定会手抽筋。本着人性化原则，号主果断来个“请听下回分解”。
来源: 分子诊断万花筒 作者：隆地熊
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雷达卡
发表于 2016-10-9 00:10
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