液态活检：病理学发展的机遇和挑战

检验之星

　　在器官病理学的基础上，人们早在12世纪前后就开始应用人体组织活检辅助临床疾病的诊断。显微镜问世后，组织病理学成为疾病诊断不可或缺的手段，作为临床病理学家也早已习惯了病理诊断从大体到镜下的病理诊断流程。然而随着生命科学理论和技术的快速发展和进步，近几十年来经典病理学的理论和技术已经经历了许多重大的变革，传统病理学的概念正在不断地延伸和扩展，病理诊断也逐步由宏观向微观世界迈进，形态与功能相结合的病理诊断成为病理学发展的趋势，临床病理的概念已经由常规的组织病理学扩展到免疫病理、分子病理，现代生命科学的理论和技术为病理学这一传统而古老的学科注入了新的生命力，也要求病理学家在适应病理诊断模式转换的同时，更要重视理念/观念的转变。如病理样本的来源除传统的肉眼可见的组织样本外更加多样、复杂，其中近几年发展迅速、临床应用前景广阔的液态活检（liquid biopsy）概念的重新提出并越来越受到重视，将是病理学家所面临的新的机遇和挑战，作为临床病理学家应尽快地认识、重视并积极主动地接受这一新技术的应用。

　　一、液态活检

　　液态活检是一种概念和技术，最早于1974年由Sorrells[1]提出，当时是应用关节腔的滑液分析来诊断滑膜疾病。液态活检广义的样本包括了血液、胸水、腹水及其他体液等，而近期重新提出的液态活检的概念，则相对专注于血液中的游离核酸（DNA和RNA）和循环肿瘤细胞（circulating tumor cells）[2]。液态活检也由一种概念和技术迅速发展成为肿瘤生物学研究领域的热点，并逐步由实验室研究步入临床应用阶段。

　　二、循环肿瘤DNA

　　早在1948年Mandel和Metais[3]在人类血循环中发现了游离核酸的存在，并作为无创性检测技术用于高危孕妇的产前诊断，进一步的研究发现肿瘤患者的外周血中也能检测到游离核酸，其中以基因组和线粒体DNA为主，称之为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），其他尚包括了RNA和micro RNA。随着ctDNA分离和检测技术的不断改进，检测的敏感性和特异性不断提高，ctDNA检测已用于人体大部分实体瘤的研究和临床应用，包括了基因突变、扩增、杂合性缺失、微卫星不稳定性、甲基化检测等，用于肿瘤个体化治疗、疗效评估，预后判断，肿瘤复发、转移的监测等方面。

　　三、循环肿瘤细胞

　　循环肿瘤细胞的概念最早于1869年由Ashworth提出[4]，当时Ashworth假设血循环中可能存在着与原发病灶性质相同的肿瘤细胞，是肿瘤播散的主要机制。Ashworth的假设因理论和技术的进步而被证实。研究证明了循环肿瘤细胞的存在并受到日益广泛的关注，目前每周约有超过20篇有关循环肿瘤细胞的英文文章发表，已有超过300项以循环肿瘤细胞作为肿瘤标志物的临床研究计划在实施[5]。早期关于循环肿瘤细胞的研究主要集中于乳腺癌，研究者发现约40％的乳腺癌患者外周血或骨髓中可以检测到循环肿瘤细胞，尤其在没有明确淋巴结及远处转移、临床分期属早期的患者，认为循环肿瘤细胞是乳腺癌独立的预后因素[6]，目前循环肿瘤细胞的研究已覆盖了人体大部分的实体瘤。

　　早期对于循环肿瘤细胞的检测仅是限于循环肿瘤细胞的分离，多采用上皮细胞标志物EpCAM分检，计数获取的循环肿瘤细胞数量来判断其临床意义。目前分离循环肿瘤细胞的技术发展迅速，包括免疫富集、离心富集、滤过富集、流式细胞仪富集等，一般采取外周血7～10ml可富集1～10个细胞。循环肿瘤细胞也由早期的简单分离、计数来判断其临床意义，进一步发展作为相关分子水平检测的重要样本，并可用循环肿瘤细胞来建立原代肿瘤模型以发挥更大的作用。

　　四、液态活检的优势和应用前景

　　ctDNA和循环肿瘤细胞的分离和检测属于无创性检测手段，随着分离和检测技术的创新发展，有着广阔的应用前景。目前已有超过300项临床应用项目在实施，主要覆盖了临床疗效及耐药监测、预后判断及临床分期、肿瘤个体化治疗的靶分子检测及肿瘤干细胞研究等[2，7-9]。相比较传统的病理组织活检，液态活检简便、无创，临床获取样本可以达到随时取样、实时监测的目的，特别是对某些深在部位肿瘤而临床很难获取满意组织标本的患者，更能体现液态活检的优势，所以液态活检一经推出，就广受相关的临床学科重视和推进。随着新一代DNA测序技术及单细胞测序技术的发展，有关液态活检相关的技术平台不断完善和稳定，ctDNA和循环肿瘤细胞的应用将会在生命科学领域具有重要的地位和作用。

　　五、液态活检目前存在的主要问题

　　虽然ctDNA和循环肿瘤细胞已得到广泛的重视和逐步进入临床应用阶段，但也面临着巨大的挑战。ctDNA主要由凋亡或死亡的肿瘤细胞释放至周围血，因此ctDNA往往是处于降解状态的小片段DNA，作为[url=]PCR[/url]扩增的模板则存在明显的不足，同时ctDNA在外周循环血中含量很低，并受到非肿瘤细胞凋亡后释放的野生型核酸的稀释干扰，增加了检测结果的不确定性。随着ctDNA分离技术、PCR扩增技术和DNA测序技术的不断改进和完善，ctDNA检测才能真正成为临床医学的应用技术。

　　循环肿瘤细胞早期研究仅是应用上皮细胞标志物EpCAM标记后分检，以计数来评估其价值。然而周围循环血中能被EpCAM阳性标记的细胞不仅仅是上皮源性肿瘤细胞，也可能包括了部分髓源性干细胞，正常代谢脱落的上皮细胞，以及部分非肿瘤性疾病如炎症性肠病脱落上皮等[4]，都可能分离出EpCAM阳性的细胞，反之产生上皮间质转化表型的肿瘤细胞则可能不表达上皮性标志物。由于目前技术上还存在种种局限性，尚不能仅凭免疫标志物来确定分离细胞的性质。近来已陆续研发了一些试剂盒，用于对富集分离的细胞进行鉴定，首先明确是否为所需的细胞类型，再确定后续的检测[4-6]。有研究认为单细胞测序技术的建立可以拓展循环肿瘤细胞的应用价值，然而在评价循环肿瘤细胞单细胞测序的同时，必需充分考虑到肿瘤异质性的问题。

　　六、结语

　　液态活检因为其具有巨大的临床应用价值和肿瘤生物学基础研究意义，是近年受到关注较多的领域之一，也引起了我国相关临床学科专家的兴趣和关注，但就目前的进展而言，仍处于早期阶段，特别是转换到临床应用方面，尚需更多的研究去支持。目前不同分离机制的设备在不断推陈出新和升级换代，循环肿瘤细胞的鉴定技术也在不断完善，相信循环肿瘤细胞分离的质量和数量将会出现新的改变，使其能更好地满足个体化诊断和治疗的需求。

　　液态活检的研究主要是基于基因和分子水平，属于分子病理学范畴，特别是循环肿瘤细胞的应用性研究，更需要病理学家的积极和主动参与，应用肿瘤病理形态学结合分子水平的检测，使循环肿瘤细胞的检测和应用最大优化，提高循环肿瘤细胞检测结果的可靠性和可重复性，不仅能使患者从液态活检新技术中最大地获益，也有利于病理学科发展，拓展分子病理领域的内涵。

作者：朱明华(第二军医大学附属长海医院病理科)

来源：中华病理学杂志