循环肿瘤细胞富集和分析的工具盘点

检验之星

1月10日，新一代测序巨头Illumina宣布将拓展到医学诊断领域。这家公司表示，它已组建了一个名为Grail的公司，希望利用Illumina的测序技术来实现癌症筛查，直接检测血液中的循环核酸。

这样的检测有时被称为“液体活检（liquid biopsies）”，主要有两种形式。Grail检测的是循环肿瘤DNA（ctDNA）。另外一些人希望通过完整的细胞来诊断疾病和评估预后和疗效，这些细胞被称为循环肿瘤细胞（CTC）。

CTC就像矿井中的金丝雀，警告着肿瘤的存在和分子特征，而此时疾病可能还没有症状。据Janssen Diagnostics的研发主管Ron Mazumder介绍，它们的丰度与病人预后密切相关。“对于转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌，你可以根据CTC的数量将病人分为预后较好或较差的。”

然而，找到它们谈何容易，CTC是极其稀少的。MilliporeSigma（Millipore与Sigma-Aldrich合并而成）的资深科学家Brian Hall表示：“在1 ml血液中，大约有700万个白细胞和10个CTC，这真的是大海捞针。”当然，CTC的确切数量因病人而异，也随着疾病进程和治疗而改变。  

为此，研究人员和各家公司设计出几种策略来帮助你捞针1。

正选和负选

由于CTC如此稀少，大多数的CTC分析工具都采用两种基本策略之一。在正选方法中，CTC是利用磁珠偶联的抗体来浓缩的，这些抗体针对已知的CTC抗原。例如，Janssen Diagnostics的CellSearch检测就利用了许多上皮性肿瘤都表达EpCAM的现象来富集CTC，这种检测已被美国FDA批准。之后用DAPI和细胞角蛋白对分离出的细胞进行染色，以确保它们是CTC，并通过白细胞标志物CD45复染，确定它们不是白细胞。  

负选策略则利用抗体来去除那些不是CTC的细胞，例如，表达CD45的。对于某些肿瘤而言，这种策略可能更优，因为不依赖所表达的CTC抗原。  

据美天旎的肿瘤学研究经理Olaf Hardt介绍，这两种策略都不能100%地回收CTC。细胞聚集成团，因此在负选过程中可能将宝贵的CTC与洗澡水一起倒掉。同理，正选策略也不可避免地会保留一些非CTC。因此，研究人员经常将正选与负选相结合，在下游分析中配对使用，如显微镜和流式细胞仪。

当然，这些策略依赖于生物标志物的鉴定，这些标志物定义了感兴趣的CTC。并非所有CTC都是EpCAM阳性的，非上皮性肿瘤，如黑色素瘤，就不是。那些经历了上皮-间质转化的肿瘤，也不是，赛默飞世尔的肿瘤产品主管Jason Johnson谈道。

无论采用哪种富集方法，一旦纯化好，CTC可培养，染色后进行显微镜或流式细胞分析，或测序。在最近的一项研究中，麻省总医院的Daniel Haber和Shyamala Maheswaran用一种正选的微流体设备CTC-iChip来研究77个CTC的基因表达谱，这些细胞来自13位病人2。一篇2014年发表在《Nature Protocols》上的文章详细介绍了CTC-iChip的设计和使用3。

CTC富集工具

美天旎提供了一系列与抗体结合的MACS磁珠，支持正选和负选策略。研究人员可以将他们的细胞混合物与适合的磁珠混合，上样到MultiMACS（平行处理）或AutoMACSpro（自动处理）系统中。

据Hardt介绍，美天旎计划在2016年推出一系列新的磁珠，以便从全血中直接富集CTC。目前，研究人员必须通过细胞裂解或密度梯度离心来去除红细胞；否则，细胞太多了，磁珠要找到它们的目标很困难。新的磁珠经过优化，不需要去除红细胞，大大节约时间。“并且丢失CTC的风险更低了，”他说。

另一个富集CTC的选择是赛默飞世尔的LiquidBiopsy流程。这个流程在2015年2月推出，包含了样品收集管，能够保留CTC长达96小时；样品处理工作站和微流体芯片，分离ctDNA、CTC和白细胞；以及Ion Torrent测序仪，读取结果。

观察CTC

分离出的CTC可以通过显微镜、流式细胞仪或测序来分析。不过显微镜的通量很低，而流式细胞仪或测序都不能真正观察到CTC。这时，MilliporeSigma的ImageStream技术可大显身手了。

Hall解释道，ImageStream是一个将流式细胞仪与显微镜相结合的成像系统。当细胞以10,000个细胞/秒的速度通过设备时，它们以60x放大倍数成像，并最多测定12个参数：侧向散射、2幅明场图像和9个荧光通道。因此，研究人员可汇集数百万个细胞的数据，以鉴定那些稀有的CTC，无论是基于形态、蛋白表达，还是RNA丰度。

这个系统的一个独特优势在于它的灵活性，可兼容新的标志物。在最近的一项研究中，研究人员对肝脏CTC进行染色，以了解肿瘤抑制抗原（p53、p16和smad4），这些曾与预后不良相关联4。“一旦科学界发现了其他标志物和其他方法来鉴定CTC，我们就可以作为探针添加，”Hall说。



参考文献

[1] Ho, KF, et al., “Quantification techniques for circulating tumor cells,” Trends in Analytical Chemistry, 64:173-82, 2015.生物通 www.ebiotrade.com

[2] Miyamoto, DT, et al., “RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance,” Science, 349:1351-6, 2015. [PMID: 26383955] 生物通 www.ebiotrade.com

[3] Karabacak, NM, et al., “Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples,” Nature Protocols, 9:694-710, 2014. [PMID: 24577360]生物通 www.ebiotrade.com

[4] Catenacci, DVT, et al., “Acquisition of Portal Venous Circulating Tumor Cells From Patients With Pancreaticobiliary Cancers by Endoscopic Ultrasound,” Gastroenterology, 149:1794-1803, 2015. [PMID: 26341722]

来源： 生物通编译   作者：Jeffrey M. Perke