循环瘤细胞，并不是你们认识的那样

检验之星

  恶性肿瘤发病与死亡率不断增高在多数情况下可以归咎于肿瘤的转移，而不是原发性肿瘤本身。由于原发性肿瘤或转移性肿瘤表面细胞的可剥离性，循环瘤细胞的存在患者的血液中。这一现象早在大约150年前就已经被医学界所认识（译者注：1869年，澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，简称CTC）的概念。），而其诊断与治疗价值仅仅是在最近几十年才引起学术界的不断关注。

    循环瘤细胞的一大特质就是与原发瘤或转移肿瘤相比他们处于一个完全不同的环境中。目前，业界通常使用固体表面的固定技术固定血液中循环瘤细胞并进行评估，这种方式的评估结果往往与真实值存在着一定偏差。自由活动的细胞在分子上与功能上与固定细胞相比都存在着一定偏差。举例来说，非附着乳腺癌细胞已被证明具备由微管蛋白构成的分子触须，这些触须给予了非附着乳腺癌细胞包括聚合、保留于器官以及与内皮细胞相互作用的动态行为。

  “这些分子触须的研究难度特别大，当肿瘤细胞与内皮细胞或其他肿瘤细胞绑定的时候这些分子触须就会解聚。”马里兰大学生物工程学院助教Christopher M. Jewell博士说。“与循环瘤细胞相比被固定的肿瘤细胞会发生极大程度的机械化学与表型变化。”

  通过对循环瘤细胞的观察，科学家们发现当肿瘤表层细胞达到一定数目时这些细胞才会从肿瘤表面脱落，这种现象看起来似乎是自相矛盾而且问题重重。而在目前看来，两大领域正因为循环瘤细胞的这些特性而受益匪浅，即肿瘤的诊断与治疗领域。

  捕获和分析循环瘤细胞不仅仅使得癌症病人的早期诊断成为可能，更准确的说，循环瘤细胞的捕获与分析也具有用于治疗肿瘤的潜力。“许多团队正在致力于开发更加有效的循环瘤细胞捕获技术，”Jewell说，“我们更关注用于分析这些循环流细胞的新技术。”

循环瘤细胞的固定技术
      为了准确地描述循环瘤细胞的生物学特征，Jewell博士和他在马里兰大学的同事生理学家Stuart Martin博士设计了一种非同寻常的微流体装置。该装置可在空间上固定循环瘤细胞同时保留这些细胞在流体中的特性。

  在这一微流体装置中，聚电解质多层膜阻止了细胞对仪器的附着，使得循环流细胞的流体功能与形态特性可以得到准确的观察与研究。同时，研究人员将脂质束缚层置入装置，与循环流细胞的细胞膜相互作用，使脂膜与循环瘤细胞产生松散连接并将后者固定，为循环瘤细胞实时成像技术的执行与相关药物的筛选提供可能。

  “我们正在努力研究使循环瘤细胞避免发育成实体肿瘤的信号差异。”Jewell博士说，“一般肿瘤细胞与其他肿瘤细胞紧密接触时会成核并形成肿瘤。”
  循环瘤细胞的表面拘束性同时也为捕获与分析他们提供了可能性。循环瘤细胞的表面拘束性使得引入药物、液体流量变化或力学性能等微干扰进而收集相同单个细胞用于成像的分析技术成为可能。在这些细胞中，细胞的形态变化可以与基因组或蛋白质组信息相关联，为细胞响应外部扰动发生变化的机械化学性质提供动态的描述与分析。

  “我们的同事。”Jewell博士说，“同时也在开发新的算法来对循环瘤细胞微触手与一些视觉指标作出量化分析。”

循环瘤细胞的捕获与富集技术
       早期的循环瘤细胞捕获技术往往依赖于细胞尺寸的不同，导至基于过滤技术的循环瘤细胞捕获技术发展良好。目前，这类技术正在逐渐向新型的惯性微流体技术过渡。涡旋技术就是其中的一个实例。

  “我们认为涡旋技术shiite一种没有滤波的过滤器，”加州大学洛杉矶分校Jonsson综合癌症中心生物工程和癌症纳米技术项目主任教授Dino Di Carlo博士说，“涡旋技术中不包括任何小于细胞尺寸的结构原件，但是细胞仍然会因为他们的大小不同得到分离。”
  Di Carlo博士和他的同事们最近开发了一种高通量涡旋芯片（High-Throughput Vortex Chip ，Vortex HT)。这种前沿的微流体技术可以基于细胞表面自由流动的标志物与细胞大小对罕见细胞进行富集与集中。这一技术具有简便的预处理步骤并可有效避免细胞损伤,在15-20分钟内可以处理约8毫升的血量。
  “通过这项技术我们可以集中100?L血液中的循环瘤细胞。”Di Carlo博士说。

  富集的循环瘤细胞可以进一步用于接下来的检测与分析，诸如实时成像或免疫染色。该技术的循环瘤细胞捕获效率最高可达83%，与Dean的非对称流分离系统与CTC-iChip相比效率稍低但Vortex HT实验结果中白细胞污染较少产生，同时样本量要求也相对较小。

  沿着循环瘤细胞这条思维路线，我们可以发现循环流DNA中的生物标志物同样可以用于癌症的无创筛查。在许多癌症患者的血浆与血清中，由于肿瘤细胞凋亡或坏死使得主动或被动释放的ctDNA都能被检测到。

  虽然ctDNA可以被用于突变信息的动态收集并同时具备某些技术在应用上的潜在优势，对于提供特定类型的信息来说ctDNA仍显得能力不足，这种情况下还是要以来循环瘤细胞。举例来说，ctDNA检测不能提供细胞形态学或蛋白表达定位的具体细节。同时，ctDNA的检测也不能为研究人员创造蛋白质组学与基因组学的分析条件。

循环瘤细胞的分析技术
    “这一领域循环肿瘤细胞潜在生物标志物得到一一列举的那一刻起正式开始，”哈佛医学院放射肿瘤学和马萨诸塞州总医院助理教授David T. Miyamoto博士说，“目前，对于循环瘤细胞表型细节的分子分析与这些分析结果在液体活检的应用是循环瘤细胞分析领域的最主要课题，这些工作可以让我们获得肿瘤组织的最真切分子生物学信息。”

  最近，Daniel Haber博士与Mehmet Toner博士领导的马萨诸塞州总医院循环瘤细胞研究中心开发了最新的三代微流体技术。前两代微流体技术在微流体表面捕获循环瘤细胞，而第三代微流体技术被他们成为CTC-iChip技术，该技术可以在溶解状态下分离目的细胞。一但循环瘤细胞被捕获或分离，他们便会具备进行“各种各样复杂分子分析”的技术条件。Miyamoto博士强调道。

  在最近使用CTC-iChip技术的研究项目中，Miyamoto和他的同事们对分离的循环瘤细胞进行了单细胞RNA测序，研究人员对来自13位病人的血样进行了富集，共分离得到了77个循环瘤细胞。

  “我们研究的目的是使用循环瘤细胞分析技术对转移去势难治性前列腺癌潜在耐药机制的鉴定。”Miyamoto博士解释说。在接受雄激素受体抑制剂治疗的前列腺癌患者中，对他们循环瘤细胞的回顾性研究揭示了非典型Wnt信号通路或许在癌细胞的耐药性产生过程中扮演着重要角色。

  “我们需要在更大的病人群体中证实我们的发现，”Miyamoto博士解释说，“但是此次概念验证性研究依然证实了详细的样本分子分析与液体活检可以在识别潜在临床相关耐药机制中得到应用，并进一步用于病人治疗的指导。”

  从变量分析到临床应用（两个障碍：CTC检测有效癌症种类有限，CTC检测敏感性有限）

  “我们在循环瘤细胞研究领域的绝大部分研究都是在晚期癌症患者中进行的，这种情况下我们通常可以直接地干预治疗。”Daniel J. O’Shannessy博士，Morphotek诊断与转化医学业务负责人告诉记者。“即便是在晚期癌症患者中，摆脱某种单一类型的肿瘤细胞，尤其是同时具备两种类型癌细胞潜在分化能力的循环瘤细胞数目具有极大的个体间多样性。”

  许多研究建立了包括乳腺癌、肺癌、结直肠恶性肿瘤等在内几种癌症的循环瘤细胞预诊断关联性。即便如此，循环瘤细胞分析行业面对的最具挑战性的问题是并非每种癌症都会有剥离至血液中的循环瘤细胞。即便是同种癌症，也并不是每个原发或转移的肿瘤团块都会产生循环瘤细胞的剥离。

  举例来说，即使是使用目前最先进的技术，卵巢癌也不会像其他癌症一样产生足够的循环瘤细胞。“另一大问题是现有的技术手段被其较低的敏感性所限制，而不是特异性。”O’Shannessy博士说，这种敏感性的不稳定性在病人间的交叉实验中显而易见，使得对于患者的纵向研究变得十分困难。

  早先，Morphotek的研究人员对其产品ApoStream进行了推广，该装置使用连续的域流辅助（field-flow-assist）与双向电泳技术分离与获取癌症患者血液中的循环瘤细胞。在最近的研究中，O’Shannessy博士及其同事使用激光扫描血细胞计数与高度选择性抗体技术对ApoStream技术不能有效分离的循环瘤细胞中叶酸受体呈α阳性细胞进行了鉴定。

  这一原理论证性研究足以证明循环瘤细胞检测技术在乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌患者叶酸受体α阳性检测中的有效性，但却不适用于扁平细胞肺癌。这样研究同时证实了特定肿瘤标记物免疫荧光技术在循环瘤细胞富集与识别中的实用性。多种检测方法的结合在某种程度上可以提高无创肿瘤检测策略的价值，精确地辨别患者患有肿瘤具体类型并区分不同类肿瘤间的具体差异。同样，类似的技术也可以用于肿瘤内异构细胞群的检测，尤其对于难以获得的组织样本更为有效。

Outliers among Outliers
     “我们都知道循环瘤细胞存在于肿瘤患者体内，但是我们实际上仍然缺乏对循环瘤细胞预诊断意义的了解，或者说我们仍然不懂得如何精确识别那些具有更大转移与扩散可能的肿瘤。”多伦多大学的生物化学教授Shana O. Kelley博士说。“我们正在试图解决这些问题，以获取更有价值的信息。”

  最近，Kelley博士及其同事阐述了一种新的循环肿瘤细胞射流芯片二维排序捕获技术。在该技术运作的第一阶段，细胞表面标记特异性DNA适配体将束缚于磁性纳米粒子，进而捕获循环瘤细胞。第二阶段中，相应的反义寡核苷酸将使细胞得到释放，并进行二维细胞分类。

  在一次概念验证性实验中，Kelley团队阐明了这一技术在分离不同表型细胞亚群中的有效性，同时，研究人员用另一种侵入性测试进一步证实了他们的结果。

  “循环流细胞方面的研究与工作进展促使着我们开发新的技术设备，更好更快地收集癌症生物标志物所携带的信息。”Kelley博士说，“我们希望我们的研究最终可以为癌症治疗与预诊断提供有效的信息支持。”

来源：转化医学网