关于RNA样品制备的流程及注意事项

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芯片样品制备

一、RNA样品

 制备流程

1. 总RNA或small RNA溶于RNase-free H2O（建议）或100%酒精，保存于-80°C，直至送样。

2. 以冰袋加上足量干冰低温寄送。

请确认使用的1.5mL离心管(EP管)管盖密合度佳，并以parafilm封口膜缠绕包装盖口。

3. 以小盒、封口袋或50 mL离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送(一天所需的干冰量约3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒即可寄出。

 送样量

1. 建议使用Trizol纯化 Total RNA (包含small RNA)，若使用市售column萃取试剂，请特别注意试剂的适用范围，进行microRNA芯片实验服务，需保留小核酸片段。

2. 请您以分光光度计检测总量与浓度，送样前参照上表取出足量的样品，并建议您进行1.5% 琼脂糖胶(洋菜胶)电泳分析，初步观察 RNA无严重降解与DNA无污染后再行寄送。

3. 要进行mRNA芯片检测服务的石蜡样品，RNA完整度要求Agilent Bioanalyzer可以检测到28S的条带为准。

二、RNA萃取服务－细胞样品 实验室接收加入Trizol lysis试剂裂解保存的细胞样品。

 样品量与制备流程

 贴壁细胞：准备 106 个细胞，去除培养液后不需PBS冲洗，直接加入Trizol reagent (Invitrogen # 15596-018，10 cm petri dish 约加入1 mL Trizol reagent)，以枪头抽吸数次，将细胞溶解后保存于-80°C。(或者将细胞以Trypsin处理后，离心去除上清液再加入1ml Trizol，并震荡将细胞溶解后保存于 -80°C。)

 悬浮细胞：约 5~10 × 106个细胞经离心收集后，去除上清液，加入 1 mL Trizol reagent，震荡将细胞溶解后保存于 -80°C。

 寄送注意事项

1. 自-80°C 取出已加入Trizol 均质裂解之细胞样品，确认各离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口。

2. 以小盒、封口袋或50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒即可寄出。

 Trizol 裂解样本的运送以能保证样品维持在4°C以下为原则。

三、RNA萃取服务－组织样品 实验室接收保存在RNAlater的检体(剪碎)，Trizol Reagent 均质或活体取下后直接以液氮快速冻存的检体。

 样品量与制备流程

组织离开活体后请于30min内进行操作，准备20 mg-100mg 的组织即可，组织块过大易拉长操作与保存液渗透时间，可能导至组织块中的 RNA降解 (degradation)：

1. 液态氮保存法：准备20-100 mg 的组织块，大小约 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm，先置于液态氮中快速冷冻，再将样品放入专门存放液态氮的冷冻小管中 (请使用抗冻冷冻小管)，保存于液态氮筒中等待均质。

2. Trizol reagent (Invitrogen # 15596-018) 保存法：准备20-100 mg 的组织块，大小约 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm，置于 1 mL Trizol reagent保存于 -80°C中等待均质。

3. RNAlater保存法：请参照RNAlater 说明书进行操作。

注意 使用 RNAlater 时，加入组织大小5-10倍体积的 RNAlater 溶液，以 RNase free 的剪刀将组织剪成小块使 RNAlater 溶液能够完全浸透，先置于4°C冰箱过夜或至少3h，再转-20°C或-80 °C保存，请勿直接置冰箱冻存。

 寄送注意事项

1. 自液氮或 -80°C (Trizol 或 RNAlater 保存) 取出样品，确认各离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口。

2. 以小盒、封口袋或 50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约 3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒寄出。

 RNAlater裂解样本的运送以能保证样品维持在4°C以下为原则。液氮或Trizol 保存的样本需要全程以干冰运送。

四、RNA萃取服务－血清/血浆样品 实验室仅接受无污染/ 感染性疑虑的血液样品。

 样品量与制备流程

1. 血清/血浆：EDTA采血管 (紫头) 采2-3 mL血液后，倒转混和均匀后，须将全血以离心进行血清/血浆与红血球分离 (建议1100-1300g，离心10min )，分离后的血清/血浆可存放于 -20°C /-80°C数周至数月。

2. 样品有特殊需求，请联络

 寄送注意事项

1. 自-20°C /-80°C取出分离后的血清/血浆样品，确认离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口。

2. 以小盒、封口袋或 50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒寄出。

 血清/血浆样本的运送以能保证样品维持在4°C以下为原则。

 全血样本白细胞分离或白细胞RNA抽提请参考文件—全血样本制备

五、DNA萃取服务－血液样品 实验室仅接受无污染/ 感染性疑虑的血液样品。

 样品量与制备流程

1. 全血：EDTA采血管 (紫头) 采1mL以上的血液后，倒转混和均匀，可暂存放于 4℃，一周内寄至公司。

2. 样品有特殊需求，请联络。

 寄送注意事项

1. 自4°C取出血液样品，血液检体贴上患者姓名及病历号，以冰袋寄送 (勿以干冰运送)。

2. 请确认离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口

3. 冰袋寄送方式：以小盒、封口袋或 50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入冰袋运送 (请勿加入干冰运送)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒即可寄出。

4. 请将检体与送检单、病患同意书及其他相关档置入盒内一起寄出。

5. 为避免检体在运送途中留滞过久(周六日无人收件)，请事先联系收件单位，并避免于周末寄到。

qPCR样品制备

一、RNA样品

 样品量与制备流程

1. 总RNA量浓度≥300ng/ul，体积≥30μl。溶于RNase-free H2O (建议) 或100%酒精，保存于 -80°C，直至寄送。

2. 如提供RNA样品，RNA变性胶电泳图谱。28S rRNA、18S rRNA在紫外灯下清晰可见，同时可见一条由tRNA、5.8S rRNA、5S rRNA的较模糊迁移较快的条带。28S rRNA：18S rRNA=2:1条带清晰无弥散现象，点样孔附近无条带（无DNA残留）。

 寄送注意事项

1. 请确认使用的1.5mL 微量离心管(EP管)管盖密合度佳，且以parafilm封口膜缠绕包装盖口。

2. 加入足量干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒寄送。

二、血浆/血清样品：

 样品量与制备流程

1. 血清/血浆：EDTA采血管 (紫头) 采2-3 mL血液后，倒转混和均匀后，须将全血以离心进行血清/血浆与红血球分离 (建议1100-1300g，离心10min)，分离后的血清/血浆可存放于-20°C /-80°C数周至数月。血浆/血清样品体积≥600μl。

 寄送注意事项

1. -20°C /-80°C取出分离后的血清/血浆样品，确认离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口。

2. 以小盒、封口袋或 50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约 3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒寄出。

三、组织、细胞样品：

 样品量与制备流程

1. 细胞：准备 5×106 个细胞，加入 Trizol reagent (Invitrogen # 15596-018, 10 cm petri dish 约加入 1 mL Trizol reagent)，以枪头抽吸数次，将细胞溶解后保存于 -80°C。

2. 组织：准备新鲜组织≥100mg，液氮或-80℃保存（提供的样本所抽提出来的总RNA的量需大于10μg。）。

 寄送注意事项

1. -20°C /-80°C取出分离后的血清/血浆样品，确认离心管/ EP 管或冷冻管盖密合度佳，且以parafilm 封口膜缠绕包装盖口。

2. 以小盒、封口袋或 50 mL 离心管包装样品，置于塑料袋中。送样单纸本请以封口袋或塑料带保护以免湿气毁损文件。将样品与文件置入盒内，以密闭性较佳或厚度较厚的泡沫盒，加入干冰搭配冰袋运送 (一天所需的干冰量约 3公斤)。以宽胶带缠绕密封泡沫盒寄出。

 Trizol 裂解样本的运送以能保证样品维持在4℃以下为原则。

资料来源北京华大基因

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来源： 琳琳猫基因

李严亮

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