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[讨论] 体外诊断试剂用牛血清的评价

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发表于 2016-3-17 15:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

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体外诊断试剂中,校准品和酶标缓冲液这两个组分中,为了稳定抗原或者酶标抗体,必须用到牛血清或者牛血清白蛋白,另外还会增加一些诸如甘露糖、甘油等物质,每一种物质的加入,都会引来新的问题,这个我们在《真实的免疫学反应》一文中详述,本文我们仅阐述牛血清和牛血清白蛋白带来的问题。

在加活性蛋白保护剂的时候,我们一般的理论原则是:添加的组分,成分要单一,背景要清晰。但在实际应用中,更多的是依据实验结果,按结果来挑选添加物。举个例子,理论上BSA成分单一,使用起来,理论上比牛血清要好,但是实际使用上,牛血清的效果一般要比BSA好很多,因此牛血清是体外诊断试剂中使用比较广泛的蛋白保护剂。本身是要解决蛋白稳定性问题,加入蛋白保护剂,但是蛋白保护剂同样会带来许多问题,并且很多问题还未被发现。

目前应用中,在夹心法领域(竞争法日后再分析),牛血清主要会带来两个比较明显的问题:

1
本底高,造成假阳
现在的体外诊断试剂研发,大家比较追求速成,一般拿到一个配对,都是拿现成的大样配方,包含包被缓冲液、封板工作液、酶标缓冲液,和现成辅料,包含空白板,按着现成的工艺和流程,进行组分制备和研发测试。
这种做法带来一个严重问题:拿不通用的配方、辅料和工艺,去做本身不能通用的研发。如果在这个时候,测试一个配对,发现本底很高,或者假阳很多,很多情况下,就会直接把问题归结为原料。再强调一遍:【拿不通用的配方、辅料和工艺,去做本身不能通用的研发】,这种做法无法准确评估试用装原料,是目前原料厂家最难沟通诊断试剂厂家的症结所在。
把本底高和造成假阳总结为同一点,并不是说他们一定同时出现,只是这两者的成因有些共同之处,对夹心法来说,这两者成因我们一般直觉有两种:
1
结构类似物引起交叉反应
有些抗体特异性不足,或者检测抗原的结构类似物太为相近,无法彻底识别,这个时候,就会有假阳。
     A、抗体特异性不足,这个好解释,看FSH、LH和HCG的a链就清楚。
     B、检测抗原的结构类似物太为相近,比如胰岛素和胰岛素原,这种前体和剪切物的检测,想单纯依靠抗体特异性识别,是很难的。
     C、有一种结构类似物,一般会被我们忽略掉,就是种属同源性,从基因序列或者蛋白质序列,我们能从理论上排除种属同源性,但是实际应用中,谁知道呢?又有谁测过呢?如果这种种属同源性,刚好就发生在牛身上呢?那你还能再加牛血清吗?
2
干拢因素
高血脂、溶血等因素我们不讨论,在测人血清时,我们最清楚的是类风湿因子和HAMA效应,牛做为一种与小鼠亲缘关系较远的动物,他同样会有牛类风湿因子和牛AMA效应。提出这点,很多人会觉得直接用阻断剂处理不就可以了,这其中有两个因素:
     A、并不是所有批次的牛血清,都会有牛类风湿因子和牛AMA效应,因此每批次的牛血清值得筛选,从源头解决问题。
     B、阻断剂并不能100%解决这个问题,换句话说,阻断剂是万不得已才使用的,也并非完美解决问题,还是以治本为主,在源头上不要引入问题。
3
奇怪现象
要是出现上面的情况,应该来说,既然都用的抗体(以双鼠单克隆抗体为主),要出现这些情况,同一个样本,或者同一批牛血清,这种情况应该在所有的项目中都会出现,但是实际应用中,只有一些项目会出现。这也许与单克隆抗体的亚型有关,以IgG分4种亚型,再两个搭成一个配对,情况就会比较复杂,具体证据在分析与收集。
2
蛋白活性降幅较大,造成稳定性差
有些批次的牛血清,在同等比例添加上面,会面临蛋白或酶标记物活性降幅较大,在37度加速破坏实验中,表现特别明显。沟通过许多牛血清厂家,这个问题目前只能由诊断试剂厂家进行批次筛选,选择合适批次。
牛血清对蛋白稳定起作用的成分,大致成分归为几类:牛血清白蛋白(BSA),免疫球蛋白,其他蛋白,未知其他因子。对蛋白或酶不起保护作用,就是这些成分不足,或者这些成分被破坏,我们初步分析下这个问题的可能原因,仅限于理论分析,实验证据还在不断寻找:
       A、血清原料造假
          这个是不得不说的事情,有些牛全血源头造假,导至血清制造厂被动造假。
       B、血清污染
          污染的定义太广,血清中掺入了下脚料成分,被重金属、蛋白酶等污染,等等各种情况都包括在这里面。
总结起来,在使用牛血清做为体外诊断试剂的蛋白保护剂时,一定要严格筛选与评价,重点评价以下几个方面:
总蛋白含量
BSA含量
IgG含量
加入使用项目,评价稳定性。

来源:抗体验证中心

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发表于 2016-9-13 11:43 | 显示全部楼层
不错,学习了
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发表于 2017-2-4 13:31 | 显示全部楼层
好帖,涨姿势了
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发表于 2017-5-3 21:56 | 显示全部楼层
真实的免疫学反应,好想看一下,可网上搜索不到,是大大还没有写吗?
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发表于 2017-9-21 16:39 | 显示全部楼层
好帖,涨姿势了
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发表于 2017-10-11 10:13 | 显示全部楼层
好贴值得收藏,谢谢
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发表于 2018-1-23 15:39 | 显示全部楼层
好帖,以前做实验就经常筛各种批次的牛血清
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发表于 2018-9-1 21:31 | 显示全部楼层
好贴!谢谢楼主!
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发表于 2018-9-1 23:01 | 显示全部楼层
收藏了!谢谢楼主分享
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发表于 2018-10-11 15:18 | 显示全部楼层
谢谢楼主,感谢
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