体外诊断试剂用牛血清的评价

笑看风云 · 发表于 2016-3-17 15:23

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体外诊断试剂中，校准品和酶标缓冲液这两个组分中，为了稳定抗原或者酶标抗体，必须用到牛血清或者牛血清白蛋白，另外还会增加一些诸如甘露糖、甘油等物质，每一种物质的加入，都会引来新的问题，这个我们在《真实的免疫学反应》一文中详述，本文我们仅阐述牛血清和牛血清白蛋白带来的问题。

在加活性蛋白保护剂的时候，我们一般的理论原则是：添加的组分，成分要单一，背景要清晰。但在实际应用中，更多的是依据实验结果，按结果来挑选添加物。举个例子，理论上BSA成分单一，使用起来，理论上比牛血清要好，但是实际使用上，牛血清的效果一般要比BSA好很多，因此牛血清是体外诊断试剂中使用比较广泛的蛋白保护剂。本身是要解决蛋白稳定性问题，加入蛋白保护剂，但是蛋白保护剂同样会带来许多问题，并且很多问题还未被发现。

目前应用中，在夹心法领域（竞争法日后再分析），牛血清主要会带来两个比较明显的问题：

1
本底高，造成假阳
现在的体外诊断试剂研发，大家比较追求速成，一般拿到一个配对，都是拿现成的大样配方，包含包被缓冲液、封板工作液、酶标缓冲液，和现成辅料，包含空白板，按着现成的工艺和流程，进行组分制备和研发测试。
这种做法带来一个严重问题：拿不通用的配方、辅料和工艺，去做本身不能通用的研发。如果在这个时候，测试一个配对，发现本底很高，或者假阳很多，很多情况下，就会直接把问题归结为原料。再强调一遍：【拿不通用的配方、辅料和工艺，去做本身不能通用的研发】，这种做法无法准确评估试用装原料，是目前原料厂家最难沟通诊断试剂厂家的症结所在。
把本底高和造成假阳总结为同一点，并不是说他们一定同时出现，只是这两者的成因有些共同之处，对夹心法来说，这两者成因我们一般直觉有两种：
1
结构类似物引起交叉反应
有些抗体特异性不足，或者检测抗原的结构类似物太为相近，无法彻底识别，这个时候，就会有假阳。
   A、抗体特异性不足，这个好解释，看FSH、LH和HCG的a链就清楚。
   B、检测抗原的结构类似物太为相近，比如胰岛素和胰岛素原，这种前体和剪切物的检测，想单纯依靠抗体特异性识别，是很难的。
   C、有一种结构类似物，一般会被我们忽略掉，就是种属同源性，从基因序列或者蛋白质序列，我们能从理论上排除种属同源性，但是实际应用中，谁知道呢？又有谁测过呢？如果这种种属同源性，刚好就发生在牛身上呢？那你还能再加牛血清吗？
2
干拢因素
高血脂、溶血等因素我们不讨论，在测人血清时，我们最清楚的是类风湿因子和HAMA效应，牛做为一种与小鼠亲缘关系较远的动物，他同样会有牛类风湿因子和牛AMA效应。提出这点，很多人会觉得直接用阻断剂处理不就可以了，这其中有两个因素：
   A、并不是所有批次的牛血清，都会有牛类风湿因子和牛AMA效应，因此每批次的牛血清值得筛选，从源头解决问题。
   B、阻断剂并不能100%解决这个问题，换句话说，阻断剂是万不得已才使用的，也并非完美解决问题，还是以治本为主，在源头上不要引入问题。
3
奇怪现象
要是出现上面的情况，应该来说，既然都用的抗体（以双鼠单克隆抗体为主），要出现这些情况，同一个样本，或者同一批牛血清，这种情况应该在所有的项目中都会出现，但是实际应用中，只有一些项目会出现。这也许与单克隆抗体的亚型有关，以IgG分4种亚型，再两个搭成一个配对，情况就会比较复杂，具体证据在分析与收集。
2
蛋白活性降幅较大，造成稳定性差
有些批次的牛血清，在同等比例添加上面，会面临蛋白或酶标记物活性降幅较大，在37度加速破坏实验中，表现特别明显。沟通过许多牛血清厂家，这个问题目前只能由诊断试剂厂家进行批次筛选，选择合适批次。
牛血清对蛋白稳定起作用的成分，大致成分归为几类：牛血清白蛋白（BSA），免疫球蛋白，其他蛋白，未知其他因子。对蛋白或酶不起保护作用，就是这些成分不足，或者这些成分被破坏，我们初步分析下这个问题的可能原因，仅限于理论分析，实验证据还在不断寻找：
   A、血清原料造假
      这个是不得不说的事情，有些牛全血源头造假，导至血清制造厂被动造假。
   B、血清污染
      污染的定义太广，血清中掺入了下脚料成分，被重金属、蛋白酶等污染，等等各种情况都包括在这里面。
总结起来，在使用牛血清做为体外诊断试剂的蛋白保护剂时，一定要严格筛选与评价，重点评价以下几个方面：
总蛋白含量
BSA含量
IgG含量
加入使用项目，评价稳定性。

来源：抗体验证中心