免疫组化在病理诊断的应用及意义

病理医师

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。

　　免疫组化在病理学诊断中的主要应用于：
　　1、确定细胞类型
　　通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚显示其形态。

　　2、辨认细胞产物
　　利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。

　　3、了解分化程度
　　大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。

　　4、鉴定病变性质
　　通过标记Ig轻链（κ、λ）可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链（κ+/λ+），后者常为多克隆Ig轻链（κ+、λ+）。而标记Bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达Bcl-2蛋白，而套细胞则表达。

　　5、发现微小转移灶
　　某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。

　　6、探讨肿瘤起源或分化表型
　　一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定来源。

　　7、确定肿瘤分期
　　判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。

　　8、指导治疗和预后
　　免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。

　　9、辅助疾病诊断和分类
　　人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。

　　10、寻找感染病因
　　人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。
免疫组化步骤

　　病理外检中常用抗体标记
　　1、上皮类标记
　　AE1/AE3最常用，胞浆阳性着色，细丝状，与低、中分子量角蛋白反应，肝细胞为阴性，而胆管细胞阳性，用于确定肿瘤为上皮源性；CAM5.2胞浆阳性着色，细丝状，包含CK8 和CK18，主要染色神经内分泌细胞和腺上皮，正常鳞状上皮阴性，用于染小细胞癌、胸腺瘤和梭形细胞癌、肝细胞癌：AE1/AE3（-） CAM5.2 （+），用于乳腺外的Paget’s病；CK34BE胞浆阳性着色，鳞状上皮和鳞状细胞癌阳性，用于染前列腺的基底层细胞，鉴别浸润癌，染涎腺肿瘤的肌上皮，用于染Mallory小体；EMA细胞膜/细胞浆阳性着色，上皮标记的替代品，浆细胞阳性，很好的内对照，用于染滑膜肉瘤、大细胞分化不良性淋巴瘤 、L&H 富于淋巴细胞的结节状何杰金、脑膜瘤EMA（+）AE1/AE3（–）、浆细胞瘤；CK7和CK20胞浆阳性着色，两者联合应用可鉴别很多种癌的原发部位，CK7 常常在胃肠道的癌为阴性 ，CK20 只有胃肠道癌和Merkel 细胞癌阳性。

　　2、间皮细胞标记
　　Calretinin细胞核和细胞浆阳性着色，核阳性着色为必需，间皮强阳性，Sertoli和肥大细胞阳性，用于鉴别间皮瘤（+）和腺癌（-），常加CEA，鉴别梭形细胞间皮肉瘤（+）和其他的浆膜腔肉瘤（-），鉴别胸、腹水中的癌细胞和间皮细胞，确定为间皮细胞，如大网膜内陷入的一团细胞或腺瘤样瘤，神经元分化标记，如中枢神经细胞瘤，帮助确诊心脏粘液瘤，几乎全为（+）。

　　3、白细胞标记
　　非何杰金淋巴瘤大致分类
　　CD20（L26），CD3怀疑T细胞淋巴瘤者加UCHL-1（CD45RO），怀疑浆细胞瘤者LCA（CD45RB），CD79a，CD138，小B细胞淋巴瘤者，CD79a，CD43（MT1）；LCA（CD45RB）几乎所有的白细胞（+），有些淋巴母细胞淋巴瘤、大细胞分化不良性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤（-），经典Hodgkin 的R-S 细胞（-），以往浆细胞瘤（-），现（+），HE 下明确的淋巴瘤不必要染LCA。

　　4、B细胞相关标记
　　CD20（L26）胞膜阳性着色，浆阳者不可判为阳性，各阶段B细胞阳性，除了原始的前B 和非常成熟的浆母、浆细胞，用于染B细胞淋巴瘤，除了小细胞、淋巴母细胞（不恒定）和浆细胞瘤常（-），梭形细胞胸腺瘤（+）；CD79a胞浆阳性着色，有/无核周聚集，全B细胞标记，包括浆母和浆细胞，标记滤泡中心比mantle和滤泡间B要弱，比CD20贵得多，用于鉴别淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，弥漫性小B 细胞淋巴瘤/白血病，浆细胞瘤常CD20(–)而CD79a >50% (+)。

　　5、T细胞相关标记
　　CD3（polyclonal）胞浆阳性着色，核周凝聚，有时高尔基体也阳性，极好的T细胞标记，与CD43不同，髓系细胞和组织细胞不着色，极好的T细胞和NK 淋巴瘤标记，虽然有些大细胞型T细胞淋巴瘤阴性；CD43（MT1）只有膜阳性才能判为阳性，T细胞、T细胞淋巴瘤、真性组织细胞肿瘤、粒细胞肉瘤阳性，一部分浆细胞瘤阳性，小B细胞淋巴瘤阳性，这一特点可辅助表明增生的小淋巴细胞为肿瘤性！EBV 感染的B 细胞阳性；UCHL-1（CD45RO）细胞膜阳性着色，有时Golgi 阳性，弥漫性胞浆阳性者非真阳性，阳性：正常/反应性的T细胞，组织细胞、粒细胞肉瘤和T细胞淋巴瘤，罕见情况下B细胞淋巴瘤阳性；CD5细胞膜阳性着色，T细胞阳性，但极少B细胞也阳性，尤其用于慢性淋巴细胞性白血病和Mantle淋巴瘤，而MALToma和Marginal Zone淋巴瘤阴性，用于鉴别胸腺癌（CD5+）和其他癌瘤。

　　6、与激活相关的标记
　　CD30（Ki-I，Ber-H2）只有膜染色和Golgi体染色才是真阳性，正常淋巴滤泡周单个的大细胞为阳性，激活的淋巴细胞阳性：如传单、弓浆虫感染、Kikuchi淋巴结炎等、浆细胞也阳性，用于大细胞分化不良性淋巴瘤、一些传统的大细胞淋巴瘤、外周T和B细胞淋巴瘤中的一些单个大细胞、经典何杰金病中的R-S细胞，但非L&H细胞、淋巴瘤样丘疹病等皮下CD30+的淋巴增生疾病、一些浆细胞瘤、胚胎性癌。

　　7、组织细胞标记
　　CD68（PGM1）胞浆内颗粒状阳性着色，较好的组织细胞和单核细胞（包括浆样单核细胞）及其肿瘤的标记，有些非组织细胞也可阳性，包括：肾小管、粒细胞肉瘤、恶黑、血管瘤样恶纤组等，髓系细胞标记；Myeloperoxidase胞浆阳性着色，常呈颗粒状，髓系细胞及其肿瘤的高度特异且敏感的标记，奇怪的是在Kikuchi淋巴结炎和狼疮性坏死性淋巴结炎中，其中的组织细胞myeloperoxidase也为阳性。

　　8、与淋巴瘤相关的标记
　　ALK-1(Anaplastic lymphoma kinase-1)胞核+胞浆阳性着色用于大细胞分化不良性淋巴瘤，不能证实ALK1+与良好预后有关，一种罕见的大B 细胞细胞瘤，ALK1 阳性而CD20 阴性，但IgA阳性；Bcl-2在核周围区阳性着色，在正常淋巴结，生发中心阴性，但mantle和滤泡间细胞强阳性，在滤泡性淋巴瘤，（>80% 病例）生发中心强阳性，阴性不能排除滤泡性淋巴瘤，也用于鉴别单核样B 细胞增生（-）和单核样B细胞淋巴瘤（+），有人用于诊断孤立性纤维性肿瘤；Cyclin-D1核阳性着色，主要用于Mantle区淋巴瘤，几乎所有病例均为阳性，有些可能为弱阳性。

　　9、与分化阶段相关的标记
　　Tdt细胞核阳性着色，不成熟的T或B淋巴细胞标记，前T前B细胞，用于诊断淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，诊断胸腺瘤（富于不成熟的T细胞）。

　　10、肌原性标记
　　Desmin胞浆阳性着色，平滑肌/骨骼肌及其肿瘤的良好标记，肌纤维母细胞有时也阳性，但肌上皮阴性，一些间皮瘤阳性,desmoplastic small cell tumor；MSA（Muscle-specific actin）胞浆阳性着色，极好的肌源性标记，用于平滑肌、骨骼肌及其肿瘤，肌纤维母细胞及相关肿瘤（恶纤组、结节性筋膜炎等），肌上皮及其肿瘤，血管周细胞肿瘤，一些间皮瘤。

　　11、血管原性标记
　　CD31细胞膜阳性着色，内皮细胞、巨核系细胞/血小板阳性，有时浆细胞/浆细胞瘤阳性，主要用于诊断血管性肿瘤：特异且敏感，识别骨髓中不正常的巨核细胞，巨核细胞系白血病；CD34细胞膜+/-细胞浆阳性着色，血管内皮/巨核细胞/血小板 +，很好的血管标记，但特异性差，多种肿瘤CD34阳性。

　　12、血管原性标记
　　Factor VIII related antigen (F-VIII) 胞浆阳性着色，常为颗粒状，内皮细胞、巨核系细胞/ 血小板阳性，主要用于血管原性肿瘤，特异性好，敏感性差，神经、神经内分泌及神经外胚层；Syn细胞浆阳性着色，是神经和神经内分泌细胞很好的标记，特异性和敏感性均好，包括：Paraganglioma、Pheochromocytoma、Neuroblastoma、Olfactory neuroblastoma、Ganglioneuroma、Ganglioneuroblastoma、PNET等；CgA胞浆内颗粒状着色，染神经内分泌细胞的分泌小泡，因此神经元和神经节细胞阴性，神经内分泌非常特异性指标，敏感性较差，阳性信号取决于瘤细胞内神经内分泌颗粒的多少，小细胞癌：信号少，类癌、Merkel细胞癌、甲状旁腺腺瘤等强阳性，神经性肿瘤可阳可阴；GFAP（Glial fibrillary acidic protein）胞浆阳性着色，星形细胞、室管膜细胞阳性，一些肌上皮阳性，星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤阳性，少突胶质细胞瘤常阴性；一些外周神经鞘瘤可阳性，涎腺多形性腺瘤常可阳性，乳腺的肌上皮有时也可阳性；S-100细胞核+/-细胞浆阳性着色，核阳性着色为必需，用处非常多；HMB45胞浆内颗粒状着色，恶性黑色素瘤和交界痣，而正常的痣细胞常为阴性，肾和肝的血管平滑肌脂肪瘤、肾被膜瘤，肺的淋巴管肌瘤病、糖瘤；Melan-A胞浆内颗粒状着色，阳性表达的细胞包括：黑色素细胞、肾上腺皮质、性索（Leydig, granulosa），用于黑色素瘤、支持- 间质细胞瘤和颗粒细胞瘤、血管周细胞瘤、肾上腺皮质肿瘤。

　　13、与乳腺癌相关的抗体
　　ER细胞核阳性着色；PR细胞核阳性着色； Ki-67细胞核阳性着色，G1, S, G2 and M phases of the cell cycle 阳性 ，Ki-67 index: 阳性细胞所占比例；P53细胞核阳性着色。正常细胞因P53蛋白很快降解故阴性，而恶性肿瘤中因突变或存在使P53稳定的因素，故可阳性；C-erBb2细胞膜阳性着色。ki-67作为细胞增殖指数，能够标记G和S期的细胞，多数肿瘤细胞和增殖活性较大的细胞如干细胞、母细胞等也会强表达，所以，单一的看Ki-67这个指标而不参考常规病理活检的报告，这个指标毫无意义。再比如，以淋巴结的反应性增生为例，滤泡性增生的患者中的淋