一、Annexin V 检测凋亡细胞膜的改变
试剂及溶液:
A 对于单独购买的试剂:
a) 10X Binding Buffer (货号:556454)
b) Propidium Iodide(PI,货号:556463):建议与以下试剂同时使用 Annexin V-FITC(货号: 556420,556419)或 Annexin V-Biotin (货号: 556418,556417)
c) Via-Probe? (货号:555816 ):核酸染料7-AAD。建议与以下试剂同时使用Annexin V-PE(货号:556422,556421)或Annexin V-Biotin(货号:556418,556417)。
d) 1X PBS Buffer (货号: 554781):8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 7H20, 0.24 g KH2PO4 ,加水至1L。 调整pH值至 7.2。 高压灭菌室温保存。
B.对于凋亡检测试剂盒(货号:556547)
a) FITC Annexin V (组分编号: 51-65874X):每个样本5 μl用量。
b) Propidium Iodide (PI,组分编号: 51-66211E)):现成的核酸染料。每个样本5 μl用量。
c) 10X Annexin V Binding Buffer(组分编号: 51-66121E)
操作步骤:
1. 取Falcon试管,按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1xBinding Buffer缓冲液制成1x106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100μl 细胞悬液。
4. 按以下体积加入AnnexinV与核酸染料:
管号 | 名称 | 荧光标记 Annexin V | 核酸染料: | 1 | 阴性对照 | —— | —— | 2 | 单阳1 | AV FITC | —— | 3 | 单阳2 | —— | PI | 4 | 样本 | AV FITC | PI |
5.轻轻混匀,室温(20°C ~25°C)避光处放置15分钟。
6.*使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时:
● 1xBinding Buffer缓冲液洗细胞一次,去上清。
● 1xBinding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg,加入到细胞管中。
● 轻轻混匀。加入5μl PI,室温(20-25°C)避光处放置15分钟。
7.各试验管中分别加入1xBinding Buffer缓冲液400μl。1小时内上流式细胞仪测定结果。
Annexin V Blocking
待测细胞与未标记的重组Annexin V预孵育,然后进行实验,是Annexin V细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断Annexin V-FITC的结合位点,这样可以证明Annexin V-FITC凋亡分析的特异性。
1. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1xBinding Buffer缓冲液制成1x106细胞/ml的悬液。
2. 在5ml的培养管中加入100μl细胞悬液(约1x105个细胞)。
3. 加入5-15μg纯化的重组Annexin V。注意,不同的细胞系,以及凋亡的不同阶段,其Annexin V位点饱和所需要的纯化的重组Annexin V含量不同。某些情况下,为达到最好效果,可以减少细胞数量,0.5x105个细胞加5-15μg纯化的重组Annexin V。
4. 轻轻混匀,室温反应15分钟。
5. 加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI,轻轻混匀,室温避光处放置15分钟。
6. 各试验管中分别加入1xBinding Buffer缓冲液400μl。
7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
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