流式细胞术之染料选择那些事儿

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作者：解螺旋.罗小黑  解螺旋原创

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很多朋友面对各种各样颜色的流式抗体，在选择及搭配上就犯了难，在此我们需要了解下流式细胞仪的各个激发光及各个接收通道是如何工作的、常见的荧光素有哪些、这些荧光的特性是什么样的。了解了这些，选择抗体和搭配不同的颜色就变得非常简单了。

我们再回过头来看看流式细胞仪的原理，熟悉一下流式细胞仪的光路系统。

从这张图中我们可以看到，激光照射细胞后会产生很多波长的信号，不同的透镜和滤光片将不同的荧光素的荧光信号区分开，由不同的通道进行接收。光信号通过光电倍增管转化为电信号，不同强弱的信号反应了细胞不同的物理或者化学性质。

不同型号的流式细胞仪所配备的激光数目和接收通道可能是不同的，常见的是488激光器、此外还有紫外激光器、紫激光器以及红激光器。通道的顺序一般为488激光器先排序，紫外或紫激光器次之，红激光器最后。来源于同一个激光器的信号，原则上按波长从短到长进行排序，当然也可以自定义通道顺序。通道既可以以数字命名也可以以主要的荧光素进行命名。

目前市场上用得最多三种激光主要是488nm、405nm、633nm。我们来看一下某流式细胞仪的通道排序和每个通道接收的荧光的纳米范围。

从这个表中我们可以看到该流式细胞仪属于3个激光，9个接收通道的类型。每个接收通道有一定的范围，530/40nm的意思是指该通道能接收510nm~550nm波长的荧光。请注意不要误解成了可以接收490nm~570nm。我们还可以看到，每个通道有个代表性的荧光素，那么是不是这个通道只能用这一种荧光素呢，答案是否定的。了解了流式细胞仪接收通道的特性，我们还需要了解下荧光素的特性。

流式细胞术发展至今，已有多种荧光素被用于流式分析，我们来看一下常见的荧光素有哪些。

注：荧光素的激发波长是指最适合激发波长，流失细胞仪不一定配备该波长的激光，可选择相近波长的激光进行激发。荧光素的发射波长是一个区间，不是一个点。上表指的发射波长是指该荧光素的最强发射波长。

除了上表的常见荧光素，目前还有Alex Fluor系列，该系列荧光素比一般的荧光素信号更强，光稳定性更好，并且很多可以代替上表中的传统荧光素，选择和搭配的原理和普通荧光素是一致的。了解了不同荧光素的激发波长及发射波长之后，我们把它对应到流式细胞仪的激光器和接收通道上，就知道该如何选择荧光素了。

在搭配之前，我们需要明白的一点，就是不同激光器对应的通道，在物理上是分隔的，比如PE-Cy5和APC，这两个荧光素的接收波长是重叠的，但前者的激光器是488nm，后者是633nm，因而这两个荧光素可以同时使用互不干扰。在搭配抗体之前，首先应该了解所需要使用的流式细胞仪有哪几个激光，选择不同激光器激发的抗体是最保守并且不会错的，比如pacific Blue（405激光器）、PE（488激光器）、APC（633激光器）这三个一起用基本不会出错。如果需要更多的颜色，需要使用同一个激光器激发的时候，关注下荧光素的发射波长，差异越大越好。看到这，是不是觉得流式抗体的选择非常简单了？

来源：解螺旋，医生科研助手   作者：解螺旋.罗小黑