ctDNA&cfDNA&CTC那点事儿——技术篇

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1.关于cfDNA的事儿

Q1：抽提的cfDNA如何质控？

A：由于cfDNA含量很低，大部分是1-100ng/ml （对于部分特殊病理状况下，可能会在这个范围之外），因此对cfDNA的质控方法是一种挑战。

Q2：抽提的cfDNA如何定量？

A：在cfDNA极其低的情况下，它的定量测定极易受到少量单链核酸，蛋白质和RNA的污染，因此对于采用紫外吸光法的定量策略，例如NanoDrop，可能并不适合。相对来说，Qubit较多地用于cfDNA的定量。另一种较精确的方法，就是采用qPCR的方法。它主要是通过针对基因组中高度重复序列（如LINE-1，Alu等）设计扩增片段，通过检测目标片段在qPCR反应中Cq值，参照基于标准品绘制的浓度曲线，从而确定cfDNA的浓度。

Q3：目前有没有特殊的方法可以在cfDNA中富集ctDNA？

A：目前由于我们对于ctDNA的性质，除了对其携带突变这一特征比较明确外，其他物化性质了解得较有限。但是由大量研究提示ctDNA大多集中在150-200bp这个大小的片段中。因此，理论上可以对这部分大小的核酸片段进行分级分离（Size fractionation），以实现对ctDNA的富集。

2.关于ctDNA的事儿

Q1：抽提ctDNA所需的血浆/血清制备，有什么特别需要注意的地方？

A :抽提ctDNA所需的血浆/血清制备过程，和常规血清/血浆制备有一些不同和需特别注意之处：

1.血清/血浆通常需要经过“两步离心法”制备，第一步离心采用常规的血清/血浆制备离心速度，第二步需要采用高转速（14000-16000g），用于去除血浆/血清中可能残留的细胞碎片和一些破碎细胞释放的基因组DNA。

2.血浆/血清制备过程尽可能避免溶血，例如减少抽血到血浆/血清制备的时间，离心转速严格控制等。因为破碎的血细胞释放的基因组DNA可能会大大稀释较微量的cfDNA，影响后面检测的准确性。

Q2：分析ctDNA的突变有哪些方法？

A：分析ctDNA的突变特征方法，根据我们关注的突变类型不同，选用的方法也有所差异：

• 待检测的是已知点突变，较常见的方法有BEAMing，Digital droplet PCR等；
• 待检测的是单个或多个基因突变，较常见的方法有SafeSeqs，TAM-Seq；
• 待检测的是基因组染色体拷贝数变异（CNV），有Digital karyotyping；
• 待检测的是基因组染色体重排，有PARE。
  
  

Q3：目前分析ctDNA最敏感的方法是那种？

A：对ctDNA分析的灵敏度也取决于关注的ctDNA突变特征，对于染色质重组这类特征，有研究表明灵敏度可达到0.002%。而对点突变检测的一系列方法，最常见的有BEAMing，digital droplet PCR等，灵敏度可达0.005-0.01%。而靶向多基因的NGS测序技术，检测灵敏度约为0.1-0.01%。

3.关于CTC的事儿

Q1：CTC的分离方法主要基于哪些策略？

A：CTC分离的方法主要基于两种基本策略，一种是依赖于免疫标记的方法，就是利用识别CTC（或非CTC）表面的特定抗原的抗体，来筛选获取CTC；另一种是不依赖于免疫标记的方法，就是利用CTC异于血液中其他细胞的物理或细胞学特质，来分离CTC。还有一些方法，是综合了两种策略。

Q2：如果要开展CTC的临床研究，建议选择哪一个平台？

A：对于乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌这三种CellSearch®已经获得FDA应用许可的肿瘤类型，CTC的临床研究建议采用CellSearch®平台。因为这使得结果与临床应用更密切相关，更便于与同领域相关研究进行比较，更便于同领域去验证。

Q3：如果要开展CTC分子特征研究，建议选择哪一个平台？

A：如果拟开展对CTC分子特征（例如基因组DNA分析，mRNA表达，microRNA表达等），那么建议可以采用细胞得率较高的CTC分离方法。整体上，负向分选和不依赖于标记的方法获得的CTC，相比正向分选能够获得更多地CTC细胞。这样在同样的外周血样品中，能够获得的CTC更多，使得后续实验安排设计更加从容。另外，在平台选择上应根据后续分子研究的类型（DNA，RNA或蛋白质），确定选择的平台是否会对检测目标产生影响（主要是一些细胞固定，及染色步骤）

Q4：如果要开展CTC功能学研究，建议选择哪一个平台？

A：如果要开展CTC功能学研究（细胞增殖能力、迁移能力、成瘤能力等），建议采用不依赖于标记的方法，一方面是因为这种方法会获得更多的CTC，另一方面这些方法通常对CTC的伤害性刺激较小，使得获得的CTC细胞活力会更强（相比之下，基于免疫标记的CTC分离中洗脱环节中巨大的剪切力会对CTC细胞活力产生很大的影响），更有利于后续的细胞培养和细胞功能测试。

Q5：CTC提取的DNA或RNA能够用于测序么？

A：CTC提取到的DNA和RNA都是痕量的，必须要通过特定的单细胞核酸扩增技术，才能用于DNA或RNA测序。

Q6：当前CTC相关技术主要存在的问题有哪些？

A：当前CTC分离技术主要存在以下问题：

•  基于免疫标记的CTC分离平台，高度依赖EpCAM抗原。

•  CTC的分离步骤标准化程度较低。

•  CTC的判读过于主观性

•  CTC细胞富集效率和回收效率难以平衡

来源：第一预防