降钙素原的标准化

检验医师

降钙素原在了解患者有无细菌感染和败血症等问题上，具有非常特殊的价值。目前，国内为了减少抗生素的使用，更加关注诸如降钙素原（PCT）检测的项目。为此，国内许多厂商纷纷自行开发或引进这个检测试剂。

一、降钙素原应用的历史

降钙素原是一个116个氨基酸的多肽，它是调解体内钙浓度激素的前体。尽管近期对降钙素原的兴趣集中于它作为细菌感染标志物的价值，这个多肽最初用于癌症的血清标志物。1970年代，多个研究者注意到在神经内分泌肿瘤患者的血清中，该成熟激素降钙素在循环中水平升高。这个升高也发现于甲状腺髓样癌、良性肿瘤、和肺部的小细胞癌患者。降钙素接着被用于随访患者接受治疗效果的血清标志物。很快，发现降钙素的前体，包括降钙素原在神经内分泌肿瘤的患者中也升高，可等同地被作为癌症的血清标志物。

1990年代，注意到具有严重全身性炎症患者血清降钙素原浓度的升高，包括烧伤中吸入性伤害、肺吸入、胰腺炎和中暑等。

1993年，Assicot和同道报告了严重细菌感染儿童血液中降钙素原的高浓度。在这个里程碑的预期研究中，从79例疑似感染的住院儿童中确定了降钙素原的价值。86%病毒性感染的儿童，他们的降钙素原依然保持较低的水平（0.1~1.5μg/L），在细菌感染儿童中降钙素原为6~53μg/L。另外，降钙素原与疾病严重性和接受抗生素治疗快速下降相关。在这个标志性的报告后，降钙素原很快被认可为成年人和儿童二者细菌感染的有价值标志物。

二、ISO 17511规定了5种计量可溯源链的上端

1、测量结果可以在计量上可溯源至SI的被测量。有可用的一级参考测量程序和一个或多个（经认证的）一级参考物质（作为校准品）。达到这样水平的有约25～30个类型的量，具有良好确定的组分，如：一些电解质、代谢物、甾体激素及一些甲状腺激素等。

2、测量结果不能在计量上可追溯至SI的量。

1）有可用的国际约定的参考测量程序（不能被称为一级参考测量程序），和一种或多种用此参考检测测量定值的国际约定校准物质。符合这些条件的量的组分，像HbA1c（糖化血红蛋白）。

2）有可用的国际约定参考测量程序，但是没有国际约定校准物质。符合这些条件的约有30种类型组分的量，如：凝血因子。

3）有可用的一个或多个国际约定校准物质（用作校准品）及赋值方案，但是没有国际约定参考程序。符合这些条件的约有300多种量，如：使用世界卫生组织（WHO）国际标准的量，像蛋白激素、某些抗体和肿瘤标志物等。

4）既无参考测量程序，也无校准的参考物质可用。制造商自行建立“自用”测量程序和校准品，为产品校准品定值。符合这些条件的约有300种组分的量，如肿瘤标志物和抗体等。

由于，至今国际上还没有公认的降钙素原参考物质或参考测量程序（方法），制备厂商只能自行建立“自用”的测量程序和一级校准品，为公司的产品校准品定值。BRAHMS公司对降钙素原的校准做法，正是ISO 17511导则规定了溯源链上端中的最后一个这样的做法，很具有特点。

三、BRAHMS建立的降钙素原一级校准品PTN47和新的第二代校准品PCT115

为了使公司降钙素原第一代产品（LUMItest PCT）确保对患者样品检测结果的持续可靠，在该第一代产品进入市场前，公司自行建立了降钙素原的一级参考制品-PTN47。

1、第一代参考物质PTN47

PTN47是一个合成多肽，仅47个氨基酸组成。这个多肽是完整降钙素原蛋白的一部分。它在BRAHMS的LUMItest PCT产品（2h）中，是PCT-标准的原始标准物质。对PCT47采用称量法和容量法配制成作为降钙素原检测的标准溶液（校准品）[为了使PTN47的量可以代表完整的降钙素原的量，在称量前换算出多少PTN47相当于真实降钙素原的量，再进行称量配制]。BRAHMS公司声明该标准可代表完整降钙素原分子。标准被称为“Urstandard PTN-47”，意即“金标准”。需要注意的是，使用PTN47作为一级校准品以及以后的产品校准品，均只用于公司的第一代LUMItest PCT产品。

2、第二代参考物质PCT115

今天，参考制品PCT115是最高级可用标准，由BRAHMS GmbH以基因重组技术制备，通过N-端氨基酸序列（Edman降解方法）和质谱分析确定纯度和含量。通过对一级校准品的系列稀释液体，经检测得到的实际检测值与理论稀释值的回归分析，实际检测值与理论预期结果比较最大偏差在5%之内为可接受。PCT115是新的“金标准”物质，用于所有下列标准产品的校准。

3、PCT115参考值的确定

由于PCT115为115个氨基酸的多肽，在参与降钙素原的免疫检测中，出现了与PTN47完全不等的免疫反应活力，为了要确保公司不同产品间对相同患者样品的检测结果一致，不可以使用称量法和容量法确定的PCT浓度含量作为检测方法的校准值。也不可在以后产品上直接以PTN47直接进行校准。考虑到PCT115与患者样品中降钙素原多肽最为接近，今后必须使用PCT115作为校准品；但最早产品已经使用了PTN47作为一级参考物质，产品已经用于市场。为了确保所有各代产品对相同患者的检测具有相同的结果，必须永远以PTN47与LUMItest PCT的组合，作为公司的一级检测系统；今后， LUMItest PCT第一代产品和发展的各代产品，在与PCT115的组合中，必须通过真实患者样品的比较，去校正PCT校准品的校准值以及实际使用的校准曲线。经校正的校准曲线还必须再次使用真实患者样品，进行方法学比较予以验证，确认各代产品与PCT校正后的校准值的组合，和LUMItest PCT与PTN47组合，在真实患者样品比对符合要求后，方可投入市场。实际校正后的各代产品，它的校准曲线真的是一条曲线，不是直线。由此确保了BRAHMS各代产品对患者样品检测结果的互换性。

4、量值传递过程

在将PTN47与LUMItest PCT组合的结果传递给新的PCT115与LUMItest组合中，以PTN47原先的标准样品S3（2μg/L）为准。依据S3，计算出PCT115范围其他标准的理论浓度。这个PCT115在溯源过程中是公司的一级校准品。

使用Passing Bablok回归进行分析，对PTN47与LUMItest组合（x）与PCT115与LUMItest组合（y）的两个方法进行比较。在对347例相关血清检测时，在完整的检测范围内具有良好关联（y=1.01x +0.05μg/L）。由此确定了这两代校准物质的互换性。

今天，BRAHMS公司在任何一代降钙素原检测产品中均使用了PCT115为校准品。但是，必须懂得，这个校准传递是以最原始的PTN47为准的。

四、我们的认识

1、BRAHMS降钙素原产品上述的校准做法，是ISO 17511导则在体外诊断产品实现溯源性的具体体现。目前，大多具有溯源性的各个体外诊断产品，均具有国际认可的参考物质或参考检测程序。对于诸如降钙素原这样的体外诊断产品，按照溯源要求需要自行建立“参考物质”或“参考检测程序”，在体外诊断产品中还很少见。BRAHMS公司的降钙素原产品溯源建立过程，应该是一个典型做法。它既有自己的一级校准品（参考物质）、又具有自己的溯源校准传递做法。所有一切全部是为了确保患者样品检测结果在使用公司产品系列中得到一致性。

2、目前国内许多降钙素原的产品宣传具有溯源性。必须指出，与BRAHMS产品比对的相关性并不代表具有溯源性，因为这仅仅是进行的方法学比较。按照ISO 17511要求，在第一章中指出：c) 在相同的计量水平下，测量相同量的两个测量程序的测量结果具相关性，但是这样的“水平”相关不提供计量可追溯性。何况，比对具有的相关系数尽管接近1，但是比对的回归关系中存在着明显的斜率小于1、还有显著截距等，均说明比对间存在着显著误差。3、如果直接使用购买的降钙素原（116个氨基酸的多肽）为公司的一级校准品，如果校准过程得当，也可以认为该公司的产品建立了溯源性。可是，由于上述BRAHMS公司建立的溯源过程，是从PTN47（47个氨基酸的多肽）开始确定了他们的溯源关系的。可以猜测，与BRAHMS公司的结果会有差异。但是，国内降钙素原产品的公司直接使用由BRAHMS公司建立的0.5μg/L和2μg/L判断限值，应该讲是有问题的。不经过具体的大量临床试验，实在无法得到可靠的判断限值，必将在临床应用上产生严重问题。

来源：检验视界网  作者：冯仁丰