在广泛的人群中使用超灵敏的NGS检测循环肿瘤DNA

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前言
循环肿瘤DNA(ctDNA)是一种有前景的无创性评估肿瘤负荷的生物标志物，但现有ctDNA的检测方法灵敏度不足或缺乏广泛的临床适用性。本研究建立了一种对癌症进行个性化深度测序的方法CAPP-Seq，可高灵敏的定量ctDNA，对NSCLC进行分析和预后。它的设计涉及多种体细胞突变，可鉴定> 95%肿瘤的突变。

研究方法
CAPP-Seq方法，即结合优化的文库与多相生物信息学方法设计“selector”，它包含生物素化的DNA寡核苷酸，靶向目标癌症基因的重复突变区域。监测ctDNA时，selector应用于肿瘤DNA来识别病人的肿瘤特异性基因突变，然后直接定量ctDNA。后续在早、晚期NSCLC患者中验证了CAPP-Seq的技术性能。

研究结果
1. 设计NSCLC 的CAPP-Seq selector：NSCLC selector包含频发突变基因的外显子、全外显子序列和跨越3个重组断裂位点的内含子和外显子（ALK，ROS1，RET）。NSCLC selector可靶向139个频发突变基因的521个外显子和13个内含子，覆盖片段长~ 125 kb。Selector标识了4个单核苷酸变异(SNVs)，覆盖了96%的肺腺癌和鳞癌患者。

2. 方法优化和性能评估： NSCLC selector测序范围设定为 ~ 10,000 ，共使用90个样本来评估和优化selector性能。观察发现血浆DNA片段的中位长度为~ 170 bp(图1a)。通过优化少量血浆DNA文库的制备，最小化测序深度波动（图1b,c）。然后对CAPP-Seq检出限和精度的影响因素进行逐一优化和性能评估（图1d-i）图1. 性能分析
(a-c) 一个血浆样本采用CAPP-Seq分析的质量参数。包括(a)循环DNA片段的长度分布，(b)所有基因组区域的测序深度，(c)4个患者血浆DNA样本测序深度的变化。(d)分析了13个NSCLC和5个健康人获取的40个血浆标本的等位基因背景率。 (e) 生物背景的分析。所有受试者的平均频率~ 0.01%。 (f) 根据平均频率对40个血浆DNA样本的个体变异进行排名，P值阈值为0.01(虚线) 。(g) 使用CAPP-Seq分析系列稀释的等位基因突变频率，5个浓度的结果如图所示。(h) 使用g的数据分析SNVs的数量对片段丰度的影响。(i) 利用数据g分析SNVs数量对预测值与观察值平均相关系数(蓝色实线)的影响。

3.  体细胞突变检测和肿瘤负荷定量:将CAPP-Seq应用到体细胞突变检测中（n=17），平均测序深度~ 5,000。结果显示：100%检测到此前确定的SNVs和融合，并发现了许多额外的体细胞变异。评估CAPP-Seq进行疾病监测和最小残余病灶检测的敏感性和特异性（n=40）。结果显示： CAPP-Seq实现曲线下面积(AUC)为0.95，同时最大敏感性和特异性分别为85%和96%。I期肿瘤患者灵敏度为50%， II-IV期的肿瘤患者灵敏度为100%，他们的特异性都为96%。因此，CAPP-Seq可以可靠的评估肿瘤负荷，并且可以达到所需的敏感性和特异性。

4. NSCLC血浆样本中监测肿瘤负荷：研究显示：1）ctDNA水平与治疗中的肿瘤大小高度相关 （图2a-c）；2）NSCLC CAPP-Seq selector 可检测单个肿瘤的多个SNVs，如可识别EGFR激活与T790M亚克隆突变的分布频率（图2d）；3）ctDNA较影像学可以更好的预测治疗疗效（图2e, f）；4）CAPP-Seq还可以监测早期NSCLC(图2g,h)。这些结果表明，CAPP-Seq在早晚期NSCLC中测量肿瘤负荷和在不同类型治疗后监控ctDNA 具有应用潜力。


图2. 无创检测和监测ctDNA
(a-h)使用CAPP-Seq监测疾病进展。 (a, b)患者治疗过程中肿瘤负荷的变化，一个IIIB NSCLC(a)，一个IV NSCLC(b)。(c) 一个IV期NSCLC患者不同报告基因之间的一致性(SNVs和融合)。 (d)检测一个IV期NSCLC患者的EGFR T790M亚克隆。左边是组织样本，右边是血浆样本。(e,f) CAPP-Seq检测治疗后血浆DNA可进行临床预后，一个IIB NSCLC(e)和IIIB NSCLC(f)。(g, h) 2个IB NSCLC分别在肿瘤完全切除(g)和SABR(h)后监测肿瘤负荷。 (i) CAPP-Seq在无组织的肿瘤基因分型或癌症筛查中潜在应用的探索性分析。

5. 无组织标本的癌症筛查和肿瘤基因分型：CAPP-Seq可将 ctDNA片段丰度大于0.4%的血浆样品进行100%的正确分类，假阳性率0%(图2i)。在等位片断丰度大于0.1%时CAPP-Seq可以无创检测EGFR和KRAS突变，准确率100%，特异性99%。因此CAPP-Seq可以应用于无组织标本的局部晚期或转移性NSCLC患者的肿瘤基因分型。

源文章：
AaronM N, Scott V B, Jacqueline T et al. An ultrasensitive method for quantitatingcirculating tumor DNA with broad patient coverage.
NATURE MEDICINE. 2014 MAY; 5(20): 548-554.

来源：靶向分子诊断