ABC for CTC 技术篇

检验之星

Q1：CTC的分离方法主要基于哪些策略？

        CTC分离的方法主要基于两种基本策略，一种是依赖于免疫标记的方法，就是利用识别CTC（或非CTC）表面的特定抗原的抗体，来筛选获取CTC；另一种是不依赖于免疫标记的方法，就是利用CTC异于血液中其他细胞的物理或细胞学特质，来分离CTC。还有一些方法，是综合了两种策略。

Q2：依赖于免疫标记的CTC分离方法及代表产品线有哪些？

         依赖于免疫标记的CTC分离方法主要有以下几种

• 阳性（正向）分选：就是利用识别CTC表面的特定抗原抗体，来筛选获取CTC。目前商业化平台使用最多的CTC抗原标志物是EpCAM。使用的物理平台有基于微珠分选（microbeads）和微流体（microfluid）分选，代表产品线有CellSearch®，AdnaTest®，CellCollectorTM，HB-Chip等。
• 阴性（负向）分选：就是利用血液细胞中非CTC细胞共有的抗原抗体，去除掉非CTC细胞，然后剩下的细胞作为候选的CTC细胞。目前主要去除的是淋巴细胞，采用的抗原标志物是CD45，代表产品线有MACS®，EasySep®。
• 综合正向和负向分选，如CTC-iChip®。
  
  

Q3：不依赖于免疫标记的CTC分离方法及代表产品线有哪些？

       不依赖于免疫标记的CTC分离方法主要有以下几种：

• 根据CTC细胞大小。通常CTC体积相比血细胞偏大，因此可以通过选择特定孔径的滤膜来实现CTC的分离。代表产品有Parsotix®，ISET®。
• 根据CTC的密度。通常CTC比重相比血细胞较大，因此可通过密度梯度离心或特定离心速度，将其与血细胞分离开。代表产品有DFF chip。
• 根据CTC的生物学性质。CTC作为肿瘤细胞，在细胞学功能上相比血细胞具有特殊性，可通过这些特殊生物学性质来分离CTC。代表产品有EPISPOT（主要是通过监测短期培养的CTC释放MUC-1，PSA，CK19）；VitaAssay®（主要是通过检测短期培养的CTC的迁移能力）。但是这类产品通常都需要和一个初步的CTC富集或分离平台联用。
  
  

Q4：选择哪一个平台开展CTC研究最合适？

       CTC所有分选平台都有各自的优劣性，选择何种平台开展CTC研究主要取决于研究目标和领域。

Q5：如果要开展CTC的临床研究，建议选择哪一个平台？

        对于乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌这三种CellSearch®已经获得FDA应用许可的肿瘤类型，CTC的临床研究建议采用CellSearch®平台。因为这使得结果与临床应用更密切相关，更便于与同领域相关研究进行比较，更便于同领域去验证（这是基于CellSearch®平台的高度稳定性和可重复性）。我们可以看到在一线肿瘤临床杂志中，这三种肿瘤涉及到CTC的研究基本上都是基于CellSearch®平台。

       对于其他类型肿瘤，CellSearch®平台基于上述原因，仍然是首选。但是其他类型的商业化平台也是被广泛接受的，因为在这些肿瘤中，CellSearch®平台的优势并没有被FDA所确认。

Q6：如果要开展CTC分子特征研究，建议选择哪一个平台？

        如果拟开展对CTC分子特征（例如基因组DNA分析，mRNA表达，microRNA表达等），那么建议可以采用细胞得率较高的CTC分离方法。整体上，负向分选和不依赖于标记的方法获得的CTC，相比正向分选能够获得更多地CTC细胞。这样在同样的外周血样品中，能够获得的CTC更多，使得后续实验安排设计更加从容。

        另外，在平台选择上应根据后续分子研究的类型（DNA，RNA或蛋白质），确定选择的平台是否会对检测目标产生影响（主要是一些细胞固定，及染色步骤）

Q7：如果要开展CTC功能学研究，建议选择哪一个平台？

        如果要开展CTC功能学研究（细胞增殖能力、迁移能力、成瘤能力等），建议采用不依赖于标记的方法，一方面是因为这种方法会获得更多的CTC，另一方面这些方法通常对CTC的伤害性刺激较小，使得获得的CTC细胞活力会更强（相比之下，基于免疫标记的CTC分离中洗脱环节中巨大的剪切力会对CTC细胞活力产生很大的影响），更有利于后续的细胞培养和细胞功能测试。常用的产品有DEPArrayTM。

         某些负向分选平台也支持后续CTC功能学研究。

Q8：CTC提取的DNA或RNA能够用于测序么？

        CTC提取到的DNA和RNA都是痕量的，必须要通过特定的单细胞核酸扩增技术（详见后续【技术宅】专题介绍），才能用于DNA或RNA测序。

Q9：当前CTC相关技术主要存在的问题有哪些？

笔者认为，当前CTC分离技术主要存在以下问题：

• 基于免疫标记的CTC分离平台，高度依赖EpCAM抗原。
  
  

        EpCAM在许多肿瘤中被证明灵敏度不够——很多肿瘤细胞并不表达EpCAM，并且EpCAM+肿瘤细胞是具有肿瘤干细胞性质（例如肝癌）。这种不足引发的直接后果，是CTC检出率偏低——相当数量的外周血样品无法检出，或者检出几个细胞（<5），从而极大地约束了CTC的临床适用范围。

• CTC的分离步骤标准化程度较低。
  
  

        CellSearch&#174;平台采用的策略，并不是最先进的，灵敏度也不是最高的（远远低于基于微流体的CTC检测平台）。但是它是唯一一款通过FDA临床应用许可的CTC平台，最核心的因素，它实现了血液样品获得后，所有CTC分离操作步骤的自动化集成。这将操作者实验操作引发的误差降到了最低，使得CTC分离检测结果更加稳定，更可被重复。

• CTC的判读过于主观性
  
  

       CTC的分离和判读是紧密联系的一个步骤，目前判读CTC的主要标准是基于一些染色方法（包括免疫组化，染色质结构异常和核型染色等）。而除了少数平台实现了判读的自动化（CellSearch&#174;），大部分依赖于观察者的主观判断，因此观察者间的误差较大。

• CTC细胞富集效率和回收效率难以平衡
  
  

        随着CTC临床应用的快速进展，未来CTC相关研究已经不满足于计数，而要在分子特征和细胞功能方面有所突破，这就要求CTC分离技术在实现高度富集的同时，也要能够实现有效地回收具有细胞活性的CTC，便于后续研究。

       但与之不匹配的是，目前主要的CTC细胞分离平台大多在富集效率（CTC占分离细胞总数的比例）和回收效率（能够获得具有细胞活性的CTC数目占总CTC数目）两个方面难以取得较理想的平衡。

     富集效率越高的平台（如微流体平台），往往意味着对CTC更强的亲和力，这也势必导至回收过程中要对CTC施加的压力更大，这必将导至回收的CTC在数量和活性上将受损。相反，损伤性较小的CTC分离平台，尽管可以较好的回收到更多，有活性的CTC细胞，但由于其特异性较低，会带入大量的血细胞，也影响CTC的后续研究。

        现在已经有新的平台不断涌现，力求实现这两者的完美平衡。例如有研究者研发出基于生物可降解材料的微流体平台，在实现高度特异性分离CTC之后，能够通过迅速降解平台材料，实现分离的CTC无损释放。Biodegradable nano-films for capture and non-invasive release of circulating tumor cells. Biomaterials 2015, 65: 93-102 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26142780）

来源：卓 & Lee 液态活检