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[分享] 生化试剂的基础知识—--详解

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发表于 2015-6-1 06:30 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一、生化试剂的分类

(一)按照化学性质分类

        1.酶类:包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE等。

        2.底物/代谢产物类:包括TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,CO2等。

        3.无机离子类:包括Ca,P,Mg,Cl等。

        4.特种蛋白类:包括apoAl,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子),IgG,IgA,IgM等。


(二)按照临床应用分类

        1.无机离子:包括Ca,P,Mg,Cl等。

        2.肝功能:包括ALT,AST,r-GT,ALP,MSO,T-Bil,D-Bil,TBA,TP,Alb等。

        3.肾功能:UA,UREA,Cr等。

        4.心肌酶谱:CK,CK-MB,LDH,α-HBDH,AST,MSO。

        5.糖尿病:GLU等。

        6.前列腺疾病:ACP,p-ACP等。

        7.胰腺炎:α-AMY。

        8.血脂:TC,TG,HDL-C,LDL-C,apoA1,apoB,Lp(a)。

        9.痛风:UA。

        10.有机磷中毒:ChE。

        11.免疫性疾病:C3,C4,PFB(B因子), IgG,IgA,IgM,Kappa链,Lambda链。


二、反应速度特性

按照反应速度,可以分为终点法试剂和动力学试剂。而动力学试剂又可再分为零级动力学法和一级动力学法。

(一)终点法试剂

终点法,指经过一段时间(一般为几分钟)的反应,反应进行到完全,使全部底物(被测物)转变成产物,称终点法,更确切地说应称平衡法,这是最理想的分析类型。如图(1)。

640.webp.jpg

整个反应达到平衡,由于正向反应的平衡常数很大,可认为所有的被测定物已转变为产物,反应液的吸光度不再增加(或降低),吸光度的增加(或降低)程度与被测定物的浓度成正比。

终点法对反应条件(如酶量、pH、温度)小的改变不敏感,只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可,是最理想的反应模型。

属于终点法的试剂主要有:

        TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,Glu,TP,Alb,T-Bil,D-Bil,Cr(氧化酶法),NH4+,CO2 , Ca,P,Mg,Cl , apoA1,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子),IgG,IgA,IgM等。

(二)动力学法试剂

1.零级动力学法

零级动力学法,指反应过程中反应速度维持不变,达到最大,与底物浓度无关,因此,在整个反应过程中,反应物可以匀速地生成某个产物,导至被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加,减小或增加的速度(△A/min)与被测物的活性或浓度成正比,主要用于酶活性的测定。如图(2)。

640.webp (1).jpg

实际上,由于底物浓度不可能足够大,随着反应的进行,底物消耗到一定程度后,反应速度不再维持不变,同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间。因此,零级动力学法是针对特定时间而言的,各试剂商对这段时间有严格规定。

属于零级动力学法的试剂主要有:

ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE ,TBA等。

2.一级动力学法

在一定的反应时间内,反应速度与底物浓度的一次方成正比,由于底物在不断的消耗,因此整个反应的速度在不断的减少,表现为吸光度的增加(或降低)速度越来越小,这类反应达到平衡的时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,必需在特定时间段内进行监测,各试剂商对这段时间有严格规定。如图(3)。

640.webp (2).jpg

在一固定时间间隔中,底物浓度的变化量正比于底物的初浓度,这是一级反应的同性。该段时间内吸光度的增加或降低与被测物的浓度成正比。

属于一级动力学法的试剂主要有:Cr(苦味酸法),UREA(紫外监测法)

三、显色原理

显色系统主要有以下几种:

  • NAD-NADH和NADP-NADPH系统
  • p-NP和p-NA系统
  • H2O2偶联的指示系统
  • 抗原抗体反应指示系统
  • 其它显色反应

(一)NAD-NADH和NADP-NADPH系统

NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰,而NAD和NADP在340nm无特征性吸收峰,利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应,根据340nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

作为该指示系统常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH和G6PDH

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有:ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α-HBDH 、 Glu、UREA、NH4+ 、CO2等。

(二)p-NP和p-NA系统

p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、ACP、r-GT、AMY等。

(三)H2O2偶联的指示系统

H2O2在过氧化物酶的作用下,可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素,导至某一波长吸光度的增加,因此可用来测定物质的浓度或活性

用于此指示系统的单一色素原有TMB、ABTS等;成对色素原有酚和4AA、MBTH和DMA等。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu、Cr、UA等。

(四)抗原抗体反应指示系统

特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物,形成一定的浊度,导至特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下,改变程度与抗原浓度成正比。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。

(五)其它显色反应

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,在一定浓度范围内颜色反应强度与蛋白质的浓度成正比。用于TP的测定。

溴甲酚绿(BCG)在非离子去污剂Brij-35的存在下,可与白蛋白形成紧密结合的绿色复合物。用于Alb的测定。

重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素。用于总胆红素和直接胆红素的测定。

甲基麝香草酚兰(MTB)在碱性条件下可与Ca、Mg形成有色络合物。用于Ca、Mg的测定。


四、性能评价方法

(一)主要性能指标:

1.稳定性:指在规定条件下经过一段时间的保存,仍能达到相应的性能指标,如试剂空白吸光度、线性范围、灵敏度等。

2.反应灵敏度:指单位浓度(或活性)的测定物反应所产生的反应度,反应度越高,灵敏度越大。

3.精密度:结果间相互符合的一致程度

4.准确度:与参考测定程序结果的一致性

5.线性范围:在规定的重复性和线性偏差下,测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。

6.基质效应:基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰,并影响分析结果的准确性。例如,溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响,这些影响和干扰被称为基质效应(matrix effect)。

7.抗干扰性:

8.其它:试剂/样本比例、反应时间、价格等。


(二)性能评价方法

        1.稳定性:连续观测,每日试验;热加速试验。

        2.反应灵敏度:直接计算单位浓度反应物的吸光 度变化或变化率。

        3.精密度:按照NCCLS EP5-A进行。

        4.准确度:按照NCCLS EP9-A2 进行。

        5.线性范围:按照NCCLS EP6-A 进行。

        6.基质效应:通过回收试验确定

        7.抗干扰性:按照NCCLS EP7-A进行。


来源:检验之星


楼主热帖
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发表于 2015-6-27 10:36 | 显示全部楼层
非常全面的基础知识分享,几乎涵盖了所有基础面,是了解试剂入门不错的材料,我是做生物化学材料的,这是我公司的网站 http://www.bocsi.com ,有相关问题可互相交流!
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发表于 2015-12-14 21:53 | 显示全部楼层
谢谢科普,刚入生化这行。
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发表于 2016-1-13 10:59 | 显示全部楼层
非常感谢,很好
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发表于 2016-7-1 16:22 | 显示全部楼层
基础知识,要夯实啊。赞
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发表于 2016-12-22 09:38 | 显示全部楼层
挺好,收下了
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发表于 2017-3-1 15:20 | 显示全部楼层
太需要了,谢谢
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发表于 2017-5-28 11:21 | 显示全部楼层
刚好要做这些东西,非常感谢!
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发表于 2017-7-28 15:52 | 显示全部楼层
谢谢分享,很全面
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发表于 2017-11-17 11:41 | 显示全部楼层
学习了,谢谢
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发表于 2017-12-1 10:38 | 显示全部楼层
谢谢分享,
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发表于 2020-1-2 11:09 | 显示全部楼层
挺不错的 ,很全面
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发表于 2023-3-1 10:38 | 显示全部楼层
非常好的科普知识,感谢分享
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