结核分枝杆菌感染诊断方法的进展

检验医师

结核病是人类最古老的传染病之一， 是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病，至今依然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病。我国的结核发病率位于世界第二，感染率为44.5％。现有的结核诊断方法存在诸多不足。临床症状和影像学特征有助于疑似患者的发现，但进一步诊断需要结合实验室检测。结核现有早期诊断手段有涂片镜检和分子检测等方法。涂片镜检虽然使用广泛，但敏感度低且易受非结核分枝杆菌的干扰。而MTB的分子学诊断虽然在涂阳标本中检出率高，但只能检出50％左右的涂阴标本，且分子诊断操作复杂、容易交叉污染，也在一定程度上限制了其在基层的推广应用。MTB分离培养是目前结核诊断的金标准，不仅具有较高的检出率，且能对菌种进行鉴定，但耗时较长（一般需培养6-8周），作为早期诊断的意义不大。MTB感染后机体主要的免疫反应为T细胞免疫，其血清抗体检测的意义不大。

全球结核菌感染者中，超过95％表现为潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）。LTBI仍可发展为活动性结核，成为主要的传染源。因此，准确诊断结核菌潜伏感染，对于结核病的预防具有十分重要的意义。由于潜伏感染者缺乏特异性症状，而且目前诊断结核潜伏感染还没有统一的标准和方法，因此很难在健康人群中快速检测出结核潜伏感染患者,特别是在其临床症状还没有出现时。

一、结核菌素皮肤试验

临床上用于判断结核分枝杆菌感染的首选方法是TST（tuberculin skin test，结核菌素皮肤试验），即皮内Mantoux试验以及PPD试验，主要以纯化蛋白衍生物（PPD）和旧结核菌素（OT）为抗原进行皮下注射的诊断方法。TST从1890年发明以来沿用至今，用于结核病的诊断已超过100年，是目前还在应用中的一种古老的试验方法。目前国内诊断潜伏感染主要依据结核菌素皮试（PPD皮试）的结果，一般将PPD强阳性或短期内从阴性转为阳性，而无临床结核病证据者判断为结核菌潜伏感染者。此法所需费用较少，简单易行。

TST的缺点首先是特异性不够好。PPD是从结核分枝杆菌中粗提的抗原混合物，包含200多种蛋白，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介菌（BCG）的共同抗原成分。对于卡介苗（BCG）作为常规接种疫苗的国家，TST的阳性或者弱阳性结果很可能是由BCG接种引起的，同时不能除外非结核分枝杆菌（NTM）感染。在中国结核病高度流行地区，由于广泛接种BCG，TST会造成假阳性；而在HIV感染患者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下的人群中容易出现假阴性。其次，TST对潜伏性结核分枝杆菌感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI）的敏感性一般，而且对于免疫抑制者结果难以确定。另外，TST检测还存在费时（48-72小时）、需要受试者回访、皮试操作和结果解释存在主观依赖性等缺点。

二、γ-干扰素释放试验

近年来，有一类用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法进入了人们的视线，即γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA），这类试验采用ELISA／ELISPOT（酶联免疫吸附/酶联免疫斑点）方法定量检测检测全血/外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病。目前这类γ-干扰素释放试验中，有两种较为成熟的方法，即Quanti FERON-TB GOLD试验（QFT-G）和T-SPOT TB试验。其对应的方法和试剂盒先后被美国FDA批准应用于临床，CDC为其指定了使用指南。

（一）IGRA的理论和基础研究

人体对于结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞免疫。T淋巴细胞和巨噬细胞的作用关系到感染的进程和演变。巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后，就会把它们消化成大小不一的片断。特异片断（抗原肽）与巨噬细胞和其他抗原递呈细胞的主要组织相容性复合体（人白细胞抗原）相结合，表达于巨噬细胞表面，并递呈给T细胞。特异性CD4 T细胞能产生特征性淋巴因子，包括一种能够刺激T细胞增殖的生长因子白介素-2和一种巨噬细胞反应中介物γ-干扰素，γ-干扰素为巨噬细胞杀菌机制所必需。

IGRA将结核菌特异性抗原加入受试者的血液标本或者含有分离出的外周血单核细胞的培养基中进行孵化，如果受试者受到过结核分枝杆菌感染，那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放出γ-干扰素以及其他一些细胞因子，我们可以通过ELISA/ELISPOT方法定量检测γ-干扰素的释放水平。通过这样的试验，我们可以诊断是否存在结核菌感染。IFN-γ为Th1细胞分泌的一种细胞因子，不但能够反映机体结核的Th1细胞免疫情况，还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核潜伏感染的诊断。

整个试验体系中，对于结核菌特异性抗原的选定是至关重要的。γ-干扰素释放试验诞生的早期曾使用PPD作为特异性抗原，由于PPD成分不单一，特异性和敏感性均不理想。后来研究者开始使用ESAT-6和CFP.10作为抗原，得到了较好的效果。ESAT-6（早期分泌抗原靶6 000蛋白,early secretory antigenic target 6）和CFP-10（培养滤出液蛋白-10，culture filtrate protein 10）的蛋白编码来源于结核分枝杆菌基因中的一个菌种特异性基因片断，称为region of difference 1（RD1）。这个基因片断不存在于大部分的非结核分枝杆菌以及所有的牛型分枝杆菌（包括卡介苗）中，因此ESAT-6和CFP.10作为抗原的特异性相对于PPD要高的多，这个显著的优异性也使得γ-干扰素释放试验得以应用于临床。

目前QuantiFERON-TB GOLD和T-SPOT TB的试剂盒主要以这两种抗原为基础。其中，QFT-G又出现了一种用试管的改良方法，称为QFTGIT（QFT-in Tube）。某些TIGRA试验除了上述两种抗原外，还常用TB7.7抗原。TB7.7是结核分枝杆菌基因组差异区13（RD13）基因编码的结核杆菌特异性抗原团。这三种抗原在BCG和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失（除外堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌），因此避免了与卡介苗和大多数非结核分枝杆菌抗原的交叉反应。

此外，对于新抗原的研究开发依然没有停止，近年来发现的肝磷脂结合红血球凝集素（Heparin-Binding-Hemagglutinin，HBHA）是新一代结核菌特异性抗原中较为突出的一个。这是一种结核分枝杆菌表面蛋白，其作用和结核的潜伏感染相关。潜伏感染者会对于HAHB产生强烈T细胞反应，而活动性肺结核则不会，因此这是一个非常有潜力的新抗原。

（二）IGRA的应用

IGRA目前还只在少数国家被应用于临床，主要是用于检测结核菌潜伏感染，此外该试验还被用于活动性肺结核的诊断、预测和鉴别诊断。近年来，一些使用IGRA检测胸水以及支气管肺泡灌洗液中的T细胞反应以检测结核分枝杆菌感染的试验也取得了较好的效果，为这类试验的应用拓展了新思路。

1、筛选结核菌潜伏感染

筛选结核菌潜伏感染是IGRA最成熟的应用领域。在这方面IGRA比TST的特异性要高，尤其是对于卡介苗接种过的人和NTM感染者。大量试验数据证明，对于潜伏感染，IGRA试验的特异性在90％以上，对于低危险人群的特异性则达到了95％以上。

目前对于结核潜伏感染的敏感性难以确定，因为没有一个金标准能判断是否真的有潜伏感染。不同地区的相关报道结果有较大的差异，高危人群和低危人群有所不同。

2、诊断活动性结核

IGRA难以区别近期结核分枝杆菌感染与活动性结核病，但是用于活动性结核与其它疾病的鉴别很有意义。大量数据提示，QFT-G试验的敏感性从55％-88％不等，平均大概75％左右。这个和TST（平均77％）差不多。而T-SPOT的敏感性比QFT-G高，因为该试验检测到的干扰素就在产生干扰素的细胞周围（一旦产生，就被结合了），而QFT-G试验检测到的是已经弥散在反应体系中的干扰素。

由于胸水中免疫反应的强度比血液中更高，因此有些试验通过检测胸水中的γ-干扰素释放水平来诊断活动性胸膜结核，这些尝试被证实是有意义的。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在多种自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-γ的治疗会导至潜伏性肺结核转变为活动性肺结核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制，TST容易产生假阴性。研究显示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介导炎症疾病（IMID）患者中检测LTBI的敏感性和特异性都比TST高。终末期肾病（ESRD）患者感染结核分枝杆菌的几率比健康人高10-25.3倍。

3、确诊阳性或者弱阳性的PPD结果

由于对于潜伏感染的特异性要比TST高的多，因此IGRA用来确认一个阳性或者弱阳性的PPD结果是很有意义的，尤其是对于BCG接种者、确诊或者疑似的NTM感染者以及面临预防性抗痨的患者。

关于IGRA的可重复性，有较多的相关试验均表明，IGRA并无助强效应（booster phenomenon）以及类似反应，可以反复进行。2003年美国CDC发布的指南中提到，使用PPD进行TST检测以后会影响QFT（第一代）的结果，因此QFT不能作为TST的补充诊断；但是后来2005年发布的关于QFT-G的相关指南就没有提到这个问题，可能是因为后来使用了其他抗原代替PPD以后，就没有了互相影响。目前关于IGRA确诊阳性或者弱阳性的PPD结果的实际效果还没有得到大量临床资料证实。

（三）TIGRA和TST的比较

评价结核潜伏感染诊断方法的最大问题是缺乏结核潜伏感染的诊断金标准，无法直接测量QFT-GIT、T-Spot.TB和TST方法的敏感性和特异性。许多研究都比较了QFT-GIT、T-Spot.TB和TST方法在结核诊断中的表现。QFT-GIT和T-Spot.TB结果具有统一性，它们都比TST更准确。许多研究结果显示QFT-GIT可以取代或辅助TST对LTBI的诊断。TIGRA比TST更敏感、特异性更强。因为TIGRA所用抗原是结核分枝杆菌所特有的，而且其操作过程和实验原理更加完善和先进。

TIGRA的敏感性和特异性都强于TST，特别是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下人群的检测中。全球有约1300万人共同感染了HIV和结核杆菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易从潜伏感染发展为活动性肺结核。

TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的儿童中，对LTBI的检出率更高。但是，TIGRA存在无法区分活动期和潜伏期结核、需要抽血获取淋巴细胞、要求专业的操作人员和具备相应条件的实验室、样品必须在采集后8h内完成等缺点，现阶段仍未能完全取代TST。另外，现阶段研究的样本都非常小，也没有诊断LTBI的金标准。

（四）IGRA的优点和缺点

1、IGRA的优点

IGRA用于判断结核菌感染的特异性明显高于TST试验，并且不受卡介苗接种的影响，这对于结核的诊断和预防是非常有意义的，尤其是在卡介苗接种率高的国家。这个试验在24小时之内就可以获得结果，花费的时间比TST短，并且不会因为助强效应受到影响，可以反复进行；此外，该试验受到主观因素的影响相对较小。在有试验条件的医院里，该实验的操作和管理比TST更便捷，不需要专门的医生多次观察结果。

2、IGRA的缺点

对于我国目前的医疗背景来说，该试验最大的缺点就是试验成本高，这限制了该试验的推广。目前该试验在我国国内的试验资料非常少，对于我国人群的判断标准还没有定论，同时该试验对于试验室基础条件也有一定要求。

此外，该试验还有一些固有的缺点：首先，时间窗较窄，因为血细胞在体外活性迅速减弱，因此8小时内必须在标本里加入抗原进行孵化；其次，该试验对于结核近期感染和活动性结核的鉴别能力较差。虽然有报道称使用HBHA作为抗原可以明确鉴别结核分枝杆菌感染和活动性结核，但是缺少足够的试验数据。

该试验结果在一定程度上受到T细胞水平的影响，对于免疫抑制或者免疫缺陷者可能会结果不准确，此外对于某些血液病、恶性肿瘤、矽肺以及慢性肾衰者，也缺少足够的数据基础。虽然有资料表明，干扰素释放试验对于HIV患者感染结核菌也有诊断价值，但是没有足够的临床研究证实。

三、其他潜伏感染诊断标志物和方法

结核分枝杆菌潜伏感染的相关蛋白可以作为血清学标志物。Hsp16.3是由结核分枝杆菌hspX基因编码的蛋白，最初被认为是免疫显性抗原，后来被确认是一个重要的膜抗原，它的表达与结核分枝杆菌的休眠密切相关。肝素结合血凝素（HBHA）是结核分枝杆菌的表面蛋白，它可以引发细菌的聚集和吸附于非吞噬细胞。TIGRA不能百分之百地检测到LTBI，因为ESAT-6和CFP-10在潜伏感染时不是高表达的。NarX和NarK2在BCG中不表达，但在潜伏期的结核感染中表达。因此，它们对LTBI的检测更敏感，而且它们可以区分潜伏感染和BCG接种。CFP21和MPT64是由RD2编码的结核分枝杆菌特有的诊断性质抗原。

IFN-γ诱导蛋白10（IP10，又名CXCL-10）其相对分子质量约为10×10^3。IP10是CXC家族的趋化因子，对T细胞和B细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞等有较强的趋化和功能活化作用，对于正常生理条件下淋巴细胞的循环、代谢和数量的稳定，以及免疫损伤局部对淋巴细胞的趋化均有重要作用。IP10还广泛参于某些病理生理过程，如调节免疫细胞的分化发育、体内的迁移和分布等。IP10在趋化效应T细胞到Th1型细胞主导的炎症部位中发挥重要作用。

TIGRA通过测量IFN-γ的释放量来诊断LTBI。白细胞介素7（IL-7）是一种细胞因子，能够稳定IFN-γ的分泌和提高蛋白产量。用IL-7提高IFN-γ检测的敏感性可以增强对LTBI的检测，特别是对免疫力低下的患者或儿童。

快速诊断结核分枝杆菌感染对于预防和控制结核病是非常重要的，临床上需要动用多种手段综合分析，做出判断。同时结核杆菌可长期以休眠状态存活，并可被重新激活而致病，及早诊断潜伏结核感染者，是控制结核传播的重要手段之一。目前，国内以TST作为主要检测手段，但TST的结果容易受到卡介苗和受试者免疫状态的影响。国外常用的TIGRA检测方法弥补了TST的上述缺点，但是不能区分活动性和潜伏性结核感染者。γ-干扰素释放实验，显示出了很多超越TST的优点，对于判断结核分枝杆菌感染有可靠的参考价值，随着方法的改进以及新抗原的应用，以后可能会成为新一代的诊断方法。

来源：检验视界网