浙江省三级医院免疫组织化学单项质量控制与评价

病理医师

随着免疫组织化学技术持续快速的发展，该技术已日益成为现代病理常规诊断中必不可少的辅助手段。尤其近十年来，一类隶属于美国食品药品监督管理局（FDA）枟免疫组织化学试剂重新分类标准枠的Ⅱ类抗体，例如雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、HER2 等检测已成为重要的预后指标，以及临床药物治疗的预测标志。免疫组织化学实验结果的准确性、重复性以及实验室之间的交流愈来愈受到重视。针对HER2 的检测标准化问题，继美国临床肿瘤协会（ASCO）和美国病理学家学院（CAP） 联合发布的2007年HER2 检测指南之后，我国也于2009发布了新版HER2 检测指南，其质量控制的重要性已经得到了临床和病理医师的广泛认同。我国各个实验室间的质量控制有开展但仍不够完善，2012 年8 月浙江省临床病理质量控制中心在2005、2006年二级和三级医院免疫组织化学专项质评的基础上，实施了新一轮的免疫组织化学单项（HER2、PR）质评（共73 家）。作为省级免疫组织化学技术质量控制工作，具有鲜明的特征和示范性。因此对此次测评的亮点和问题做一综述和讨论。

一、测评方法

1．测评平台的建立：作为浙江省临床病理质量控制中心（以下简称省中心）省级培训基地之一，浙江省肿瘤医院病理科是全国首批通过中国国家卫生部病理质量控制评价中心（PQCC）HER2 参比实验室认证的单位，多次获得全国免疫组织化学测评一等奖，并参与多项全国HER2 流行病学研究。实验室在浙江省较早应用自动化免疫组织化学染色仪，年平均完成3 000 例以上的HER2 免疫组织化学检测和500 例荧光原位杂交（FISH）检测，同时也是浙江省临床病理质量控制中心所在地。浙江省临床病理质量控制中心成立25 年来，在全省病理科建设、质量控制以及专业队伍培训方面积累了丰富的组织和管理经验。

2．测评流程与方法：（1）确定本次免疫组织化学质量控制评测的抗体项目（HER2、PR）。（2）省中心向各病理科实验室统一分发空白切片，确认无误后同时提供空白片基本信息，如所包含的组织（乳腺癌）。（3）HER2、PR 各2 例检测样本（A、B 为HER2 项目、C、D 为PR 项目），每例空白切片均为同一蜡块的3 μm厚连续切片，以阳离子片帖附，经70℃烤片1 H。（4）每家参评单位可获每例1张空白片及相应编号（如A1、B1、C1、D1）的参评片。（5）同时提交参评单位本次评测2 种抗体项目的室内阳性及阴性对照染色片，以及相应空白片2 份（需有真实病理号）。（6）各参评单位严格使用自己的抗体按日常操作规程染色，均需通过网上录入系统平台，提交抗体信息、染色流程及判读结果。（7）所有参评染色切片由专家小组统一盲评、讨论，评价完毕后中心将反馈给各实验室一份带有评估的评分表，包括对其技术问题的原因分析及相应的改进建议。

3．测评对象及时间：参加对象为浙江省三级甲类及三级乙类综合性医院病理科，合计73 家（浙江大学医学院附属口腔医院、浙江大学医学院附属儿童医院另行安排，省肿瘤医院病理科作为省中心测评资料提供单位除外）。2012 年6 月8 至10 日浙江省病理技术会议期间发放质量控制测试片，2012 年7 月各单位自行上交，2012 年8 月评审并反馈结果。

二、结果分析

1．测评工作的亮点：（1）所有参评单位均需通过网上登录录入系统平台，提交染色流程、抗体信息等，自动生成电子管理文库。（2）所有参评染色片均行数字化病理切片扫描，将整个载玻片全信息、全方位快速扫描，使传统物质化的载玻片变成超清晰数字化图像，并建立永久电子存档免疫组织化学染色图库。由于图像质量恒定不变，且可以多图对比观察，保证了每次分析数据的准确性。（3）为保证此次测评工
作的准确和公正，中心组织10 位病理学方面的专家（包括特邀国内著名专家）参与评审，参照统一的评价标准独立完成。

结合指南严格评判，将评价分为判读和染色两方面进行，使评价细则标准更具科学性和严谨性。比如，判读方面包括：判读是否存在“过评”、“低评”或报告不规范；染色方面则包括：阳性信号的定位，信号的强弱和分布，交叉反应，背景着色，对比染色等。

2．测评结果及影响因素：本轮参加活动单位涵盖了浙江省大中型医院，因此测评结果能够基本反映出浙江省目前免疫组织化学（HER2、PR）检测的技术水平，同时也为省中心更好地开展专项免疫组织化学规范培训打下良好的基础。评价证明浙江省免疫组织化学（HER2、PR）的总体质量尚可。其中HER2 和PR 的切片优良率分别仅为54.8％（40/73）和43.8％（32/73）；相比2005、2006 年二级及三级医院免疫组织化学专项质评HER2 和PR 的优良切片率61.8％（76/123）和69.2％（45/65）反而略有下降。原因可能有试剂来源的部分原因，以及评判标准的改变（我国新版HER2 检测指南发布于2009 年）等多方面的因素。影响测评结果的因素，主要体现在以下三方面：（1）抗体的选择：抗体无疑是免疫组织化学技术最核心的试剂，其质量直接影响结果，目前我国多数实验室使用的是“家酿检测”（in-housesystem），一抗、抗原修复、染色方式等各不相同。不同谱系或克隆的选择仍然是比较突出的问题。从本次测评汇总来看，由于收费价格、成本等因素浙江省免疫组织化学自动化的应用比例极低，抗体使用的情况与国外有很大不同，尤其HER2 的检测鲜有采用FDA 批准的检测试剂盒，但即便是手工染色优片率亦较低。英国国家外部质量评估服务局（UKNEQAS）对21 个国家90 多个实验室的调查报告指出，使用HERCepTesT 试剂盒的实验室检测重复性更高。但也有学者报道，HERCepTesT 因敏感性过高而产生过多的假阳性，其与FISH 的符合率低于DAｋｏ 公司的A0485 抗体。NorDiQC 则在14 轮测试后发现使用FDA 认证通过的4B5 克隆，其稳定性和高合格率达96％，远高于“家酿检测”。通常选择有良好资质的经销商购买进口分装产品，尤其是获得相关部门认证的试剂和标准化试剂盒应优先考虑。新购抗体和不同批号的抗体必须有探索最佳染色条件的预实验。（2）抗原修复的质量控制：大量实验验证，加热抗原修复可大幅提高免疫组织化学染色的敏感性。尽管其原理没有最终解释，但方法学的有效性验证主要围绕使用何种缓冲液和采取何种加热方式。全自动免疫组织化学染色仪基本采用精确的半导体加热技术，配合较多使用的ＥDTA 高ｐH 缓冲液可以实现绝大多数抗原良好暴露，目前国外基本成为主流。然而从本次测评汇总来看，浙江省免疫组织化学手工染色中仍大量使用柠檬酸ｐH 缓冲液，并配合使用高压加热方式。结果显示在HER2、PR 检测时高压法的重现性和染色强度均未见优势，水浴法尽管应用者不多，但结果较理想。因此，免疫组织化学手工染色方式时采用水浴法抗原修复，配合使用ＥDTA 高ｐH 缓冲液，可以最大限度地模拟全自动免疫组织化学染色的半导体加热，值得推荐。（3）主观因素：本次测评工作获得了各级医院病理科的大力支持，从汇总填表信息来看，检测的影响因素始终离不开操作者这一主观核心。测评结果的高低与科室管理层及操作者的重视程度、操作者的内部质量控制以及自身技术和认识水平等密切相关。例如：有部分参评单位填表信息不完整，使用抗体未注明克隆或来源，其中HER2 有1 家，PR 有6 家。参评单位均能提供室内阳性及阴性对照染色片，但其中HER2 项目没有一家单位主动提供相应的FISH 结果。可见无论参评单位是否具有开展FISH 检测的能力，对HER2 项目的严格方法一致性验证的重要性认识不足。我国2009 版HER2 检测指南已采纳ASCO/CAP 的评分标准，已有3 年之久。本次测评尤其注重各参评单位的判读结果，然而遗憾的是统计结果显示HER2项目中判读存在“过评”有21％（15/73）；判读存在“低评”有11％（8/73）；报告不规范的则更多，达48％（35/73）。

三、建议与展望

2012 年浙江省免疫组织化学单项质量控制与评价，是在借鉴国内外先进经验基础上并结合浙江省自身特点的较为成熟的室间质量控制的探索。对比国外发达国家的经验，我们需要做长期实践的准备，省中心计划每年定期开展相关测评和培训工作。NorDiQC 对HER2 等测评截至2012 年已进行14 轮次的总结，来自日本等发达国家的经验表明设法引进更为客观、标准的图像分析系统，对提高分析评判的准确性和重现性有极大的帮助。落实各单位的反馈信息，加强各实验室的深度交流以及随后开展的质量控制培训项目显得尤为重要，真正实现对于日常工作的监督指导作用，最终使免疫组织化学工作更好地推动病理事业的发展。


来源：中华病理学杂志2014 年5 月第43 卷第5 期　  作者：张谷 程国平 倪型灏 孙文勇