关于诊断试剂盒常遇到的概率问题

huangchj03

在研发过程中，一定会遇到试剂盒优化的问题，尤其是检测灵敏度，文件YY/T 1182-2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》上规定了定性检测限：检测生产企业生产浓度值的样本20次，至少17次检测结果符合5.8.1要求，5.8.1要求检测限应符合生产企业声称的值。我之前一直有个误解就是检测限就是试剂盒的最低检测浓度或者是极限检测浓度的含义，但是在日常研发中，针对于低浓度的梯度模板，常常表现出一下情况，比如浓度为10copies/ul、5copies/ul、3copies/ul、1copies/ul等样本，20次的平行结果常常表现出20个阳性、19-20阳性、1-3个阳性、0-1个阳性等，具有良好的重复性，于是我们按照定义将该试剂盒的检测限定在了5copies/ul。那为什么3copies/ul、1copies/ul的样本也会有阳性扩增呢，很显然这里面存在统计学概率问题，当初没有仔细思考过，只是觉得3copies/ul等样本在取样时也存在取到浓度为"5copies/ul"的具体模板的可能性，于是20个平行也存在一定的阳性结果。后来认真思考后发现这样考虑还不够，于是就提出了这个问题。
          这个统计学问题是我自己想的，一直没有认真计算过，拿出来请教一下：假设一个分子检测试剂盒的最低检测浓度为10copies/反应，前提一，不考虑样本提取过程中的富集作用；前提二，每反应加样2ul，现提供验证样本200ul，浓度为5000copies/ml，问题是同时做20个平行实验，17个以上为阳性的结果的概率是多少？会者不难，难者不会，为促进交流和学习，希望大家踊跃参与！

huangchj03

发布这个帖子后，昨晚我自己认真的计算了下，以下是我的计算过程：
第一：我考虑每次吸取的模板含有DNA的量参考泊松分布，即描述在一定空间（长度、面积、体积）或一定时间间隔内点子散布状况的理想化模型，所以我认为样本满足泊松分布，而不是正态分布。
第二：解答过程。
      先求出每2ul样本中平均质粒数或DNA数μ=10coipes；
      再求出每2ul样本中有x个DNA的概率，P（x）=10∧x/x!e∧10,带入x=0、1、2、3。。。 。。。，即可得出相应的概率P（0）、P（1）、P（2）。。。
P（0）≈0.0000454；P（1）≈0.000454；P（2）≈0.00227；P（3）≈0.00756；P（4）≈0.0189；
P（5）≈0.0378；P（6）≈0.0631；P（7）≈0.0901；P（8）≈0.1126；P（9）≈0.1251；P（10）≈0.1251；P（11）≈0.1137；P（12）≈0.0948；P（13）≈0.0729；P（14）≈0.0521；P（15）≈0.0347；P（16）≈0.0217；P（17）≈0.0128；P（18）≈0.00709；P（19）≈0.0037；P（20）≈0.0018.。。。
根据最低检测浓度为10copies/反应，因此当每2ul样本溶液中小于等于9个时，即检测不到。
P（≤9）=0.458，P（≥10）=0.542
20个平行全部为阳性的概率为P20=0.542∧20=4.786×e-6
19个平行全部为阳性的概率为P19=0.542∧19×0.458×20=8.089×e-5
18个平行全部为阳性的概率为P18=0.542∧18×0.458∧2×20×19÷2=6.493×e-4
因此P＞17=0.000735≈0.735%＜1%
这样的几率几乎不可能发生。
同时我计算了一下如果样本浓度5coipes/ul，每反应加入2ul，平行20次，17次以上阳性的概率达到95%以上得到的检测试剂盒所需要的最低检测浓度为4copies/反应，即2000coipes/ml.计算得到的P（≥4）=0.9818。因此当我们的试剂盒根据定义检测限为10copies/反应时，其实试剂盒最低检测浓度可能为4copies/反应。
以上是我的分析，其实我没有多大把握，一旦我用错模型就有可能出错，但是我想以上结果一定出乎所有人的意料，也能解释一些我们实验中的问题，希望高人指点，让这个问题不再是问题。

huangchj03

我将这个主题加了精，希望有更多看到的人一起讨论这个问题，支持我的计算过程也罢，认为我的计算存在问题也罢，各抒己见，说出合理的理由，让这个帖子成为真正的精华帖，拜托大家

会飞的鱼

你的模型主要问题有两个：1、溶液的均一性还是相对比较好的，你用泊松分布不合适。2、检出限的定义你没有考虑。检出限通常来说也是统计学概念。因此，你说检出限为10,9肯定不会检出是不对的。也会检出的，只不过检出概率和10的不一样，要低于10.

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-25 00:07
你的模型主要问题有两个：1、溶液的均一性还是相对比较好的，你用泊松分布不合适。2、检出限的定义你没有考 ...

很感谢你的回复，对于你第一个回答，我不认可，我也思考过泊松分布是否适合相对均一的溶液，后来我觉得还是可以用来说明问题的，因为任何我们“认为”的均一其实都不是均一，DNA分子一直处于“布朗运动”，浓度为5copies/ul的溶液，你吸取2ul，里面含有10个的可能性最大，但是9个和11个的可能性和10的可能性也相差不大，至少我主观上接受这个结论，这也是泊松分布计算的结果，所以我选择了泊松分布模型作为我计算的理论依据；第二个问题，检出限的定义，我是考虑的，也在反复考虑，所以我最后把我的问题进行了小改动，就是将检测限标注为最低检测浓度，将它与文件中的检测限概念分清。因为如果按照文件中的检测限的话，我这个问题就不是问题了，根据文件要求定性的检测限的规定就是20个平行要有17个以上检测，那就是100%，我问这个问题就没有意义了。
       我本来想问一个更极端的问题，当初出题时想改成最低检测浓度1copies/反应，样本浓度为500copies/ml,加入2ul的题目，这在市面上试剂盒很常见，但是我没有这样做，因为这样算出来个觉得更荒唐。严格意思上讲1copies/反应绝对是理论最低浓度了，但是如果你真的是按照文件中的检测限定义提供样本浓度为500copies/ml,加入2ul去验证的话，我想不可能做到的，这也是我思考这个问题的一个出发点。

会飞的鱼

你没有看到我说的问题重点。检测限不管哪个算法，都不是说低于检测限的都是检测不出来的，也是有一定概率检测出来的。但是你的计算过程中是将低于检测限的是百分之百不能检出的。这就是概率的差距。
你的检出限的定义绝对不是检出限的定义。


实际上就是9copy检出的概率*9copy出现的概率+8copy检出的概率*8copy出现的概率+7copy........+1copy检出的概率*1copy出现的概率。 这部分概率被你给无视掉了。当然你算出的数值偏小的。

之所以检出限定10，就是因为10的时候统计学上比较稳定，至少有95%的几率是阳性。而9可能只有60多，8可能只有40多，等等，但是，还是有可能会被检出的，按照你计算概率的方式是不能忽略的。你的前提是小于10就不能检出，这个前提错了。

会飞的鱼

定外，你的最低检测浓度这个是你造出来的概念，请问你是将其检出的概率定位多少？如果定位95%，那么就和检出限是一样的了，如果你定在5%,那么为什么计算总概率的时候不加上？总之自定义概念要慎重。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-25 17:56
你没有看到我说的问题重点。检测限不管哪个算法，都不是说低于检测限的都是检测不出来的，也是有一定概率检 ...

我很喜欢这样的争论，这样才能越辩越明，首先一点，最低检测浓度不是一个概念，但是它必然存在，不一定是一个确切的值，我是我在做纯理论研究时必须要假定一个具体的值，不然没法计算了。
我并没有说浓度低于5copies/ul的样本一定检测不到，比如浓度为3copies/ul的样本，每取2ul并不是一定为6copies，它也存在7、8、9、10copies的概率，也就是说你如果拿3copies/ul的样本做20次平行，一定存在一定的概率有阳性扩增，但是出现20次平行有17次以上阳性的情况的概率就很小了，我并是说低于某浓度的样本一定检测不到，只是在讨论某个浓度情况下的概率问题，不知道这样说你是否明白。

会飞的鱼

“根据最低检测浓度为10copies/反应，因此当每2ul样本溶液中小于等于9个时，即检测不到。” 这是你的原话。但我可以肯定的说，9个的时候，至少有80%以上的概率能够检测的到，同理，8个、7个、6个都有一些概率能够检测到。

因此，
“P（≤9）=0.458，P（≥10）=0.542
20个平行全部为阳性的概率为P20=0.542∧20=4.786×e-6
19个平行全部为阳性的概率为P19=0.542∧19×0.458×20=8.089×e-5
18个平行全部为阳性的概率为P18=0.542∧18×0.458∧2×20×19÷2=6.493×e-4
因此P＞17=0.000735≈0.735%”

这些你的算法全部都有问题了。考虑到即使2ul里面只有一个拷贝也有显现阳性的可能，20个样本全部显示阳性的概率要大上很多。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-25 21:13
“根据最低检测浓度为10copies/反应，因此当每2ul样本溶液中小于等于9个时，即检测不到。” 这是你的原话。 ...

我想你理解有问题，我把最低检测浓度定在了10copies/反应，就决定了吸取的样本里含有的DNA模板小于等于9copies时是扩增不出来的，不然就不叫最低检测浓度，我想你一定是弄混了概念。
我的意思是如果模板浓度为3copies/ul，你吸取2ul作为模板确实存在大于等于10copies的可能，因此时可能出现阳性扩增的，但是我并没有说如果你吸取的模板里面含有的DNA≤9是有扩增的可能性，我是认为当具体的模板＜最低检测限时，一定扩增不出来

会飞的鱼

我明白了，你把检测结果的不精密度和溶液的不均一性给挂上钩了。认为检测结果的不精密度都是由于溶液的不均一性造成的。

“比如浓度为3copies/ul的样本，每取2ul并不是一定为6copies，它也存在7、8、9、10copies的概率，也就是说你如果拿3copies/ul的样本做20次平行，一定存在一定的概率有阳性扩增，” 你的原话。

可是，为什么不考虑你检测方法的探针和扩增导至的对同样浓度样品而导至的检测结果的不一样的概率？例如在3copy/ul的情况下，由于方法的问题导至的阳性率只有15%， 5copy/ul的时候阳性率有50%，在10copy/ul的时候就有98%,因此将10copy/ul定为检出限？

所以，你只考虑了一个方面，没有考虑另外一个方面。两个方面一结合，还是不要考虑了。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-25 21:26
我明白了，你把检测结果的不精密度和溶液的不均一性给挂上钩了。认为检测结果的不精密度都是由于溶液的不均 ...

我也想考虑更多的因素，但是要一个一个来分析，我想你也应该明白当分析一个因素时，就必须假定其他因素不受影响，不然就没法分析问题了，你不觉得是这样吗？
如果我把最低检测浓度定在1copies/反应，在这个基础上讨论，可能就更加清晰了，这样说吧，样本浓度为1copies/ul，每次取1ul做模板，你觉得1ul样本里面为0copies的情况是多少，难道非常均匀的样本里面就不可能去到2copies的DNA吗？这些情况都是有概率的，我就是要打破一个观念就是浓度为1copies/ul的样本，就认为取1ul一定就是1copies的固有观念。
我们也可另辟一贴讨论其他因素对检测限的影响问题。

会飞的鱼

问题是你考虑的是阳性检出率，而阳性检出率除了取样的不均性意外，同时还有检测方法本身的不精密度。而这个本身的不精密度往往又包含了取样的不均匀性。

“我也想考虑更多的因素，但是要一个一个来分析，我想你也应该明白当分析一个因素时，就必须假定其他因素不受影响”

你这就是瞎扯了（请原谅我爆粗）。对于独立变量，你可以一个一个研究变量对结果的影响，但你不可以根据一个变量的影响就下出结论。就好比说你研究药物对人是否有效，你需要同时至少研究透吸收速率和浓度维持两个变量。只研究了吸收速率，不管浓度维持，然后因为吸收速率快就说这个药一定很有效？如果浓度维持不住也很容易起不到效果你就不管了？

“因此P＞17=0.000735≈0.735%   这样的几率几乎不可能发生。”你看你的结论都出来了

对于有可能有包容影响的，例如低浓度样本的检出率，其本身可能就包括了样本的不均一性，这种都不考虑，还考虑什么？

会飞的鱼

另外，你一个一个变量研究，只适用于独立变量，对于关联变量，你必须一起考虑。不然现在那些实验室设计理论都是瞎扯的？

但是不管你研究几个变量，最关键的是，没有考虑全，或者至少你觉得没有考虑全，请不要下结论。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-26 12:36
另外，你一个一个变量研究，只适用于独立变量，对于关联变量，你必须一起考虑。不然现在那些实验室设计理论 ...

你相信我的结论也罢，不相信也罢，这是我对我遇到的问题的一种解释，是我从统计学角度入手进行的解释，我没有要求能解释完所有的问题，但是能回答我遇到的或我看的现象就行，是不是还有其他关联的问题，不是我要重点考虑的，我只探讨概率问题。
再有一点，对于你说的“一个一个变量研究，只适用于独立变量”的观点我也不认可，事物之间都存在着联系，这是辨证学观点，没有独立的事物，因此，我却你也不要钻牛角尖，你可以不认可我的数学模型，但是如果你学过统计学的话，你不会没有概率的概念，你可以指出我在计算过程中的错误，提出自己的模型，能更好地解决这个问题。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-26 12:34
问题是你考虑的是阳性检出率，而阳性检出率除了取样的不均性意外，同时还有检测方法本身的不精密度。而这个 ...

我的结论是依据统计学计算结果得出，基于我的命题里面的数据得出相应的实验结果出现的概率不足1%，已经表现出了极显著，当然可以下结论。我没有必要一定要考虑其他因素，这就是理论研究，我希望你在统计学方面进行讨论，没必要牵涉其他的。
再有一点我说明一下，统计学本身考虑就是均匀肉样本取样的不均一性，我换个说法吧，均匀样品取样的不均一性本身就是统计学概率的另一种表达。

会飞的鱼

好吧，我知道为什么没有其他人来回答你的问题了。因为你讨论的目的只是计算的方式有没有错误，不考虑设置前提。

我无法指出你的统计学计算错误，我只能指出你的前提是错的。就好像屠龙一样，我不能说你屠龙的方式方法是错的，我只能说世界上没有龙。

类似的事情我也做过，基于一个我无法证实的假设，然后给出了正确的推理。但是，有用么？能解决什么问题？除了复习一遍计算公式。人家只要否定我的假设，就能否定我的推理结论。

所以，你在QQ上提出这个问题的时候，回答的人除了讨论一下分布，没人对你的过程或结论感兴趣。因为基于片面的前提进行讨论是没有意义的。

另外，给你一组数据，也许你能够理解我一直在说什么。
某试剂，在5IU/ml 时，阳性率为100%（180个样本），3时，阳性率为97%，1时，阳性率为80.3%，0.5，阳性率为50.3%，检出限为2.3.  每个浓度检测的样本数均在50-200之间。再用你的理论算一下？尤其是0.5IU/ml的那个。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-26 22:30
好吧，我知道为什么没有其他人来回答你的问题了。因为你讨论的目的只是计算的方式有没有错误，不考虑设置前 ...

有没有人参与讨论与我的前提设定有什么关系？这个论坛人气本来就不足，你没有必要在人气上做文章
我的前提怎么就片面了？我讨论的就是概率对检测限计算的影响，为什么一定要考虑其他因素对检测限计算的影响？
“某试剂，在5IU/ml 时，阳性率为100%（180个样本），3时，阳性率为97%，1时，阳性率为80.3%，0.5，阳性率为50.3%，检出限为2.3.  每个浓度检测的样本数均在50-200之间。再用你的理论算一下？尤其是0.5IU/ml的那个。”
对于你这个问题，很显然也受到概率事件的影响呀，既然你的检出限为2.3，为什么3时，阳性率为97%，而不是100%，按照你的解释1时，阳性率为就应该为0呀，为什会有80.3%？说明一点你的这个试剂盒最低检出浓度不是2.3，而是更低的浓度，只是受到取样概率的影响，导至你在检测高浓度的时候并不一定100%检出来，这完全可以用概率来解释，当然我并不否认还有其他因素的影响，以及我的计算采用的数学模型是否更符合实践操作得到的结果，但是我通过计算确实发现取样的概率对精准计算是很在很大影响的。不知道我的解释你是否接受，但是我能用我的理论解释你的现象。

huangchj03

会飞的鱼 发表于 2015-1-26 22:30
好吧，我知道为什么没有其他人来回答你的问题了。因为你讨论的目的只是计算的方式有没有错误，不考虑设置前 ...

你把你的实验的具体数字给我，我给你计算一下你的试剂盒最低检测浓度是多少，我需要说明一点的是我说的最低检测浓度并不是国家规定的检测限。你也不要说我创造新的词汇，这个是存在的一个界限，但我这样说你也不要就认定就是一个具体值，因为我们判断阳性和阴性仅仅是划定一个数值而已，都是相对论的

kinghaobin

个人认为在灵敏度检测限的浓度5copies/ul的样本有50%几率可检出，50%检不出。按照二项式分布，20次实验，其中至少17次呈阳性的概率为0.1288%。可以参考CLSI EP-12A验证灵敏度。