病理组织石蜡切片制作体会及常见问题解析--李慧

病理医师

作者及简介：李慧，女，硕士，山东大学附属省立医院病理科医师。

    病理组织石蜡切片染色是临床诊断的重要辅助手段。石蜡切片不易脱片，染色后可被长期保存，使得石蜡切片同患者病历一样，可被长期封存，对预防医疗事故的发生有一定作用，故被各大医院广泛应用。常规病理切片的制作步骤中有许多注意事项。本文主要从组织固定取材、脱水包埋、切片、漂片等过程，介绍病理石蜡切片制作过程中易出现的问题和解决办法，以期进一步改善常规病理切片的制作，提高病理切片质量。

１、组织固定取材注意事项

临床所取标本要新鲜，否则细胞内溶酶体会破裂，造成细胞自溶。组织固定液多选用１０％中性福尔马林，其有效成分为甲醛，甲醛易挥发，使得福尔马林的效用会越来越低，所以福尔马林最好现配现用；固定液体积要超过标本的１０～２０倍，否则固定不充分，影响染色；固定标本的容器要以使标本不变形为宜；取材时，除严格按照病理标本取材操作规范外，小标本一般全取，大标本在去除不必要的组织后，要特别注意病变部位与正常组织交界处；取材切片观察面要平整，否则组织经脱水后变韧，导至组织包埋时不能压平于包埋盒中，切片时修整蜡块很繁琐。广东病理人家收集整理

２、脱水包埋注意事项

现组织多采用程序化脱水浸蜡，所以要根据标本的多少及大小及时更换脱水机内试剂，否则会影响脱水效果，使组织与蜡不能相溶，无法制作出合格的组织蜡块。条件允许的情况下可根据组织标本的不同选择合适的石蜡，组织韧性大选择高熔点石蜡，组织软选取低熔点石蜡。包埋时，组织要充分压平于包埋模底部，以保证组织的预期观察切面在同一水平；先向包埋盒中灌滴少许液体石蜡，此步骤可使成型蜡块底部光滑平整，再将组织观察面压平于包埋盒底部，组织摆放紧凑但不重叠。为使包埋组织的蜡块快速凝固，一般先将浸液体蜡的包埋盒置于冷冻台上，蜡块在置于冷冻台上后，应在蜡大部分或完全凝固后（图１Ａ），再移动包埋盒；若蜡块未完全凝固（图１Ｂ），而移动了包埋盒，成型蜡块底部平整度相差甚远，有的凝固蜡块底部平整（图２Ａ），有的蜡块底部不平整（图２Ｂ），可致小标本在修片的过程中被浪费。

３、切片注意事项

切片时常见问题及常用解决方法如下：

（１）切片横向褶皱过多，不能成带（图３）。原因：蜡块温度过高；切片刀变钝；切片刀边缘粘有少量石蜡。解决方法：将蜡块重新放置冰袋或冷冻盒上，使蜡块降温；更换切片刀的位置，或换新的切片刀；或用水沾湿纱布，顺切片刀刀口方向，轻轻擦拭切片刀。

（２）切片上有位置固定的一道或几道裂缝或裂纹（图４）。原因：切片刀有小缺口；蜡块内有杂质或体积较小的似骨（钙）化性较硬的组织；包埋时蜡块不均匀凝固。解决方法：移动切片刀或更换新的切片刀；用少量盐酸软化硬的钙化性组织；重新包埋蜡块。

（３）切片上有位置不定的数道小裂缝或裂纹（图５）。原因：蜡块温度过高；切片刀变钝。解决方法：将蜡块重新放置冰袋或冷冻盒上，使蜡块降温；更换切片刀的位置，或更换新的切片刀。

（４）切出的蜡条明显向一侧弯曲变形（图６）。原因：弯曲处蜡块质地不均，蜡块未修整好，边缘毛糙等；弯曲处切片刀变钝。解决方法：重新修整蜡块；移动切片刀；冷冻蜡块，蜡块质地稍变硬后也可以使弯曲变小。

（５）切片厚薄不均，或是每固定几片后，切出一张完整的片子。原因：蜡块过硬或过大；蜡块夹持器或切片刀松动；切片机微动失灵，不能调节出正确的切片厚度。解决方法：组织块过硬可重新取材包埋，过大可重新包埋；调整机器，上紧刀片；修理机器。

图３ 蜡条横向折皱过多，无法看出组织轮廓

图４ 蜡条上可见１条明显的纵向裂纹（箭头）

图５ 蜡条上可见无数纵向裂纹，位置不固定（箭头）

图６ 蜡条明显向右侧（箭头）弯曲

４、漂片注意事项

漂片温度选择比蜡块熔点低１０℃即可。温度过高会使蜡条产生数目不等的小气泡。

５、烤片注意事项

烤片时温度与时间的选择范围广，可从３７℃烤箱烤干１天至７５℃烤箱烤干２０ｍｉｎ，可以根据不同目的需要，确定烤片时间和温度，或是依石蜡熔点来确定，一般将温度控制比石蜡熔点高１０～１５℃。广东病理人家收集整理

６、染色注意事项

（１）组织脱蜡透明等过程采用物质分子相似相溶原理，试剂有效成分容易减少，所以脱蜡试剂要及时更换，若脱蜡不充分，会使切片染色不均匀；因乙醇、二甲苯等易挥发，故在操作完成时，应及时封盖，溶液浓度降低会影响洗片效果；（２）染色时，盐酸乙醇分化步骤尤其重要，分化的目的是使胞核染色，而无背景色。明矾苏木精性质使其在酸性溶液中呈现红色，在碱性溶液中呈现蓝色。在盐酸乙醇分化时，切片由深蓝变为粉红色时，应停止分化。分化时，有经验者可以肉眼观察切片至粉红色时终止分化，初学者可镜下多次观察切片，至切片除胞核外，无其他背景着色时，停止分化；或是依据盐酸乙醇浓度，确定分化时间，试剂初配制时，盐酸乙醇浓度高，分化时间短，反之则分化时间延长。切片分化完成后，将切片移至弱碱性的溶液中返蓝，一般采用自来水，或是温度在５０℃的自来水中，因其本身为弱碱性，且取用方便，所以被广泛使用。

７、封片注意事项

（１）需吹干或烤干切片上水分，否则镜下观察时有一层白雾，导至细胞轮廓不清楚；（２）病理组织切片ＨＥ染色一般采用中性树胶封片，封片时以无气泡为准，否则会影响镜下观察；常用２４ｍｍ×３２ｍｍ大小的盖玻片，只需用一次性的巴氏吸管滴２滴中性树胶即可，过少则致封片不完全，过多则致中性树胶外溢。

本文转自《临床与实验病理学杂志》２０１４年７月；３０（７）