循环肿瘤细胞，外周血游离DNA，外周血游离mRNA与肿瘤个体化治疗

检验医师

根据肿瘤患者自身遗传学背景和肿瘤细胞生物学特性选择化疗/分子靶向药物的“个体化治疗”已成为迄今提高治疗效果、减少无效治疗公认的最有价值的新的用药方式。近几年随着肿瘤发生和抗肿瘤药物耐药分子机理研究的不断深入，分子标志指导下的肿瘤个体化治疗已逐渐被人们所认同。这一新型的药物治疗模式已于近年开始走向临床，并成为部分靶向/化疗药物个体化应用的依据。

循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（CTC）指因为侵袭、脱落、手术操作等内外部因素导至的进入血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在外周血中丰度很低，所以如何高效率高纯度地分离CTC一直是研究的热点。CTC分离富集技术主要包括：密度梯度离心，免疫磁珠分离，过滤分离，微流控芯片等。能够广泛应用于临床的检测手段必须具有灵敏度高、特异性强、重复性好且相对廉价的特点，然而，目前的CTCs检测手段虽然种类繁多、原理各异，但是都没有能够完全具备上述特点。近年的一些研究表明，应用微装置（microdevice）分离检测CTCs取得了较好的效果，将为CTCs的检测开辟出一条新路。

针对恶性肿瘤患者生存期的诸多研究证实了CTC计数具有预后判断价值。2004年，根据一项多中心前瞻性研究结果， FDA批准了Cell SearchTM System用于预测转移性乳腺癌患者生存时间。该研究中，他们将177名晚期乳腺癌患者按照治疗前CTCs的数量分为两组（<5个/7.5ml为良好组，≥5个/7.5ml为不良组），随访发现不良组与良好组相比拥有明显较短的中位PFS（2.7 vs 7.0月，P<0.001）和OS（10.1 vs >18 月，P<0.001），这一结果证实了治疗前CTCs的计数值可以作为预测晚期患者预后的一个独立因子。Cohen等利用Cell SearchTM System分离并计数了430例转移性结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞，并根据计数值将患者分为良好组（CTCs<3个/7.5ml）和不良组（CTCs≥3个/7.5ml），与良好组相比，不良组的PFS和 OS都明显缩短。在胃癌方面，也有系统的Meta分析显示CTC计数是一个重要的预后指标，CTC计数低甚至是未检出的患者无论在无复发生存还是在总生存时间都明显具有优势。

为了实现“实时液体活检”这一目的，针对CTC的诸多后续检测正逐渐成为焦点。Alix-Panabieres报道了用EPISPOT检测系统对捕获到的CTC进行培养及分析其特定蛋白的分泌情况。2013年Science杂志上发表的一篇文章中，研究者们在微流控芯片捕获CTC的基础上，开创性地发明了一种针对被捕捉的 CTC 进行 RNA 原位荧光杂交的技术（RNA-FISH）以直观展示CTC内某种RNA的量，并通过该技术实施了乳腺癌患者CTC发生上皮-间质转变过程的监测。此外，近年来针对单个细胞行DNA测序的技术已经能够实现，诸多文献报道了单个细胞测序的研究结果，他们的解决方案是对单个细胞的全基因组做一个预扩增（WGA）。利用这一技术手段，Heitzer等研究人员率先对单个CTC进行了二代测序，证实了该方法在单个CTC的DNA分析中的可行性。

外周血游离DNA

数十年前研究人员就已经发现肿瘤DNA会在外周血中出现。随着检测技术的不断发展，近年来已有研究人员报道利用检测外周血游离DNA来监测某些已知的治疗相关的DNA突变情况。在指导个体化选药方法，这是一个崭新的领域，目前较为肯定的结果是游离EGFR突变。J Clin Oncol等多个知名杂志多篇文献报道，游离EGFR突变与肿瘤组织EGFR具有很好的一致性，同时对于EGFR-TKI的使用也有很高的指导价值。2013年， N Engl J Med报道乳腺癌患者血浆中的游离PIK3CA突变与肿瘤负荷、药物疗效等有关，且具有比传统的肿瘤标志物CA15-3更高的灵敏性。因此，基于循环DNA的突变检测对于肿瘤组织药物敏感性判断可能提供比组织DNA更为全面的信息。这些正面的肯定性的研究结果都推进了人们对于外周血游离核酸的认识，展示了外周血游离DNA在指导个体化药物治疗方面的巨大潜能，为肿瘤的个体化治疗向无创、实时迈进指明了方向。

微阵列比较基因组杂交技术（array-CGH）和二代测序技术使得利用外周血游离DNA探究肿瘤的染色体拷贝数改变也成为可能。Murtaza等则利用二代测序技术，通过外周血游离DNA检测，同时成功获取了肿瘤染色体拷贝数改变和DNA突变的信息，他们的研究于2013年发表在Nature杂志上。

测序技术和array-CGH技术的发展使得外周血游离DNA能够提供更多的肿瘤相关信息，对监测肿瘤基因状态的改变，探究肿瘤内部异质性有重要的价值。而且，不同于CTC检测，对外周血游离DNA的检测无需捕获或富集步骤，相对而言技术难度更小，且不受CTC表面分子的限制。然而，外周血游离DNA往往同时含有诸多正常细胞的DNA片段，在机体良性疾病或者炎症状态时会受到较大干扰。另一方面，不同于CTC研究所处的单个细胞水平，外周血游离DNA可能反映的是所有病灶的一个平均水平。因此，目前研究人员普遍认为，CTC和外周血游离DNA各有优劣，或许结合两者结果共同分析能够更好地揭示肿瘤内部异质性的情况。

外周血游离mRNA

虽然血清/血浆游离mRNA的存在早已为实验证实，但是由于mRNA较DNA更容易在体外降解，因此需要更高的RNA抽提与定量检测技术来满足外周血清中游离mRNA的检验。这方面的相关系统性的研究在近几年才见诸文献。2008年，O'Driscoll等采用全基因组芯片和qRT-PCR的方法检测乳腺癌组织和血清游离mRNA，发现肿瘤组织可检出的mRNA中有17.8%存在于相应患者血清中。Garcia 等研究发现结肠癌患者血浆游离RNA主要为mRNA分子，这些RNA分子以多粒复合物的形式存在，具有较高的稳定性。

在临床研究中，血清/血浆游离mRNA检查可以用作肿瘤微转移存在的依据。2008年以后又有文献进一步发现结肠癌患者肿瘤组织与血浆hTERT-AT mRNA表达水平呈显着相关，且均能够反映病情进展的程度，提示游离mRNA 能够客观反映肿瘤信息。类似的结论在乳腺癌研究中得到证实。在血清/血浆游离mRNA与药物疗效相关领域的研究，也开始有相关文献报道：乳腺癌患者血浆游离CyclinD1和TS mRNA表达水平与乳腺癌患者预后及药物治疗疗效相关；血清游离Her-2 mRNA水平与Her-2 蛋白水平具有相关性。

转编汇：源正细胞