新生儿母婴血型不合溶血病的实验室诊断技术综述

检验之星

新生儿母婴血型不合溶血病（heamolytic disease of the newborn，HDN）是因母婴血型不合、母亲产生的抗胎儿红细胞抗原免疫抗体IgG通过胎盘进入胎儿体内，致敏的胎儿红细胞在网状内皮系统被识别、清除，从而导至溶血。该病仅发生在胎儿期和新生儿早期，可导至早产、死胎、流产、胎儿水肿、肝脾肿大、贫血、黄疸，严重者易并发胆红素脑病，致新生儿死亡或遗留智力发育障碍。在我国以ABO血型不合多见，是引起HDN的主要原因，其次是Rh血型不合。近几年来，不断有报道其他血型系统引起的HDN，如Kell系统、Kidd系统、MNSs系统、Duffy系统、Colton系统、Diego系统和Ger2bich系统等。HDN的早期诊断有助于早期干预，降低新生儿病死率，对优生优育、提高人口素质也有重要意义。

一、发病机制

本病的病因是母婴血型不合。胎儿的血型基因一半来自母亲，另一半来自父亲，来自父亲的基因恰好是母亲所缺少的，胎儿的红细胞就有可能刺激母体产生抗体，这种抗体的性质为免疫性抗体，并且能够通过胎盘。一旦这种抗体通过胎盘进入胎儿血循环，就可能与胎儿红细胞相结合并破坏红细胞而发生溶血现象，严重者可引起胎儿贫血、水肿、流产、死胎、早产及HDN。

（一） ABO新生儿溶血病

ABO血型不合新生儿溶血病是由于母婴ABO血型不合，母体的IgG抗A或抗B经过胎盘进入胎儿血循环破坏胎儿红细胞引起HDN。由于自然界中广泛存在着A型和B型物质，如寄生虫感染、预防接种等都可以使孕妇产生免疫性抗A及抗B抗体，即孕妇体内可以在妊娠前已存在免疫性抗体，所以ABO系统新生儿溶血病可以在第一胎就发病。从理论上讲，母/子血型为O/A、O/B、A/B、B/A等组合都有可能使婴儿发生HDN，但实际上90%以上的HDN患儿母亲为O型，这与O型母亲含有丰富的IgG抗A（B）抗体有关。A（B）型母亲所生B、AB型（A、AB）新生儿仅少数发生溶血病。IgG抗A（B）抗体效价与溶血程度有一定相关性，但并非绝对，这可能与新生儿A、B抗原强弱型物质的含量、胎盘的屏障作用及IgG亚类不同等有关，ABO HDN一般不易做到产前准确预报。

但由于ABO HDN的发病程度与母体内IgG抗A、抗B的效价有一定相关性。因此，可以定期检测孕妇体内IgG抗A（B）的效价来判断胎儿的受害情况，如果母体内IgG抗A（B）效价随着孕期增加而增长，提示胎儿受害的可能性增大。患儿出生后第二天出现黄疸，5天达高峰，一般有贫血、肝脾肿大等症状，严重者可引起核黄疸，智力低下或胎儿水肿。

（二）Rh新生儿溶血病

Rh HDN是由于母婴Rh血型不合所致的Rh免疫抗体作用于胎儿红细胞造成的高胆红素血症。Rh血型抗体只能由人类红细胞作为抗原刺激引起同族免疫作用而产生，一个Rh阴性妇女，与一个Rh阳性男子配偶，他们的子女多为Rh阳性，但Rh阴性的人血清中并没有天然存在的Rh抗体，必须经过免疫才能产生，所以第一胎的子女一般不会受害，除非以前有输血史或流产史。当第一胎小孩在分娩时，可能引起产道损伤，胎盘出血，其红细胞便可进入母体内，刺激母体产生Rh抗体。此外，对一个没有妊娠史的Rh阴性妇女，如果在怀孕前输过Rh阳性血液，也可产生Rh抗体，血清有Rh抗体的妇女，如果受孕一个Rh阳性胎儿，Rh抗体也可能通过胎盘进入胎儿体内，破坏胎儿红细胞引起HDN。Rh HDN一般可做到产前预报。

大部分Rh HDN发生在母亲是Rh阴性的情况，抗体种类有抗D、抗cD、抗DE、抗CD、抗CDE等，汉族人中大约60%与抗D有关。

Rh HDN也可发生在Rh阳性的母亲，这是由于母、婴的C、c、E、e等抗原不合所产生免疫反应的结果，汉族人Rh HDN中约37%与抗E有关，其它抗体引起的HDN机率较低。Rh阳性的Du型人也可产生抗D；母亲为Rh阴性，胎儿为Du型也可发生Rh HDN。患儿出现黄疸的时间早，病情一般较重，易出现贫血、黄疸（核黄疸）、肝脾肿大，甚至水肿等症状，如果不及时治疗可引起新生儿死亡。

二、HDN的主要临床症状和体征

被IgG抗体致敏的胎儿红细胞在分娩前后加速破坏，这在临床上有多种表现、轻重不一。严重的可以导至胎儿宫内死亡，轻者只在血清学中有所表现，而婴儿却很健康。HDN的病理变化主要是由于红细胞溶解所引起的，包括溶血本身所引起的变化和胎儿红细胞破坏后代偿性的变化两个方面。水肿、黄疸、贫血和肝脾肿大是HDN的主要临床症状和体征。黄疸深者可能并发核黄疸。症状轻重一般取决于母亲抗体的强度、抗体与红细胞结合的程度、胎儿代偿性造血的能力以及免疫功能等诸多因素。除上述严重的HDN外，临床上最常见到的是病情不很严重以至轻微的HDN。有些轻微病例通过直接抗人球蛋白试验，可确证婴儿红细胞已被同种异型血型抗体包被，但无红细胞破坏及溶血的临床症状、体征。这类临床不严重的HDN常常是RhD抗原以外的血型抗原引起的，但是并不是说非RhD抗原所致的HDN都是不严重的。

ABO HDN与Rh HDN比较，无论是黄疸程度、贫血轻重、肝脾大小和核黄疸发生率都比较轻。

三、产前诊断

（一）血清学检测

1、血型检测

对父母进行ABO和Rh血型检测，以确定父母血型是否配合，此为新生儿溶血病的初筛试验。父母血型不合可能导至母婴血型不合，但父母ABO和Rh血型配合，并不能完全排除HDN，因为仍有其他血型系统不合的可能性。如父母ABO血型不合要做相应的抗A（B）效价检测，ABO系统HDN由IgG抗A（B）引起，检测孕母血清中有无抗A（B）IgG抗体及其效价，可预测发生ABO系统HDN的可能性。

2、抗体筛选和鉴定

检测孕母血清是否存在有临床意义的抗体。如父母ABO和RhD血型配合，可加用父亲细胞做抗体筛选，以免漏检。如果孕母血清和抗体筛选细胞反应阴性，仅与父亲细胞反应出现阳性反应，则提示孕母血清中存在针对低频率抗原的抗体。很多血型抗体是IgM和IgG的混合物，当IgM效价≥IgG时，可用22疏基乙醇（22Me）、二硫苏糖醇（DTT）或血型物质（如唾液）来破坏或中和IgM。当检出某一抗体后，可用抗血清来鉴定父母红细胞相应抗原。鉴定孕母血型可以印证抗体鉴定的结果，鉴定父亲血型可以推测胎儿红细胞是否可能含有相应的抗原，从而推测胎儿是否可能受害。如果该抗体经证实有意义，则应继续测定抗体效价，以此评估抗体水平并监测其前后一个月内的变化。一般认为只有当抗体效价≥64时，才有可能使新生儿发生溶血，如果抗体效价持续升高4倍，则提示孕母免疫系统可能受到胎儿刺激，胎儿可能受害。抗体亲合力的检测可反映抗体与红细胞的结合能力，且与HDN严重程度相关性比抗体效价更好。以检测抗RhD亲合力为例：用孕母血清致敏O型RhD（+）红细胞，达到平衡时，用ELISA方法检测结合到红细胞上的抗RhD，计算Ka值，即为抗RhD的亲合力。但实验条件要求相对较高，受温度、反应介质等影响，可行性比较差。

血清学方法可用于孕早期弱抗体检测，灵敏度较好，但检测出来的抗体效价与HDN严重程度相关性仍然欠缺，提示疾病的严重程度还受抗体浓度以外因素的影响。如：母亲抗体亚型和糖基化、抗体结构、位点密度、胎儿成熟度、组织中存在血型抗原、IgG传送功效、胎儿脾功能成熟度、影响Fc片段功能的多态性以及人类白细胞抗原（HLA）相关的抑制抗体存在。

3、抗体亚型检测和CD32多态性检测

IgG有四种亚型，IgG1最易穿过胎盘，其次为IgG3、IgG2，IgG4相对不易穿过胎盘。而IgG1和IgG3与吞噬细胞结合能力强，IgG2和IgG4不能与吞噬细胞结合。当IgG1和IgG3存在时，可发生严重新生儿溶血病。用ELISA法或流式细胞仪可以定量检测总IgG、IgG1和IgG3浓度，是评价HDN严重程度的重要参数。IgG穿过胎盘需要一种特殊的受体FcRn来调节，FcγRⅡa（CD32）是其中一种低亲和力的IgG受体，主要在淋巴细胞和单核细胞表面表达，然而CD32识别各种IgG亚型的能力受其基因多态性的影响。2009年，一项研究证实HDN患儿和其母体内HR131基因型的频率较高，而HH131基因型的频率较低，同时进一步证实CD32的基因型为HR131的个体，其血液IgG1和IgG3浓度也相对较高。因此PCR测定CD32基因型可间接评估HDN的发生概率。

（二）羊水及B超检测

测定羊水吸光值（OD450）的变化，了解其胆红素样色素的情况，可预测胎儿宫内溶血程度。羊水的OD值随着胎儿孕周和HDN的严重程度的增加而增加，因此需对其进行处理校正，经校正过的羊水OD值可以反应HDN的严重程度。因羊水穿刺有一定的危险性，所以只对高危胎儿进行羊水穿刺。此外由于HDN可致胎儿水肿，对检测出具有临床意义抗体的孕妇，应从孕中期进行B超监测。

（三）分子生物学方法

由于基因决定表型（抗原），所以分子生物学方法因其敏感度高，一直被应用于医学各个领域。血型基因型是目前最热门的研究课题之一，现已能检测的血型基因型有RhD、c、E、Cw、K、Fya、Fyb、Jka、Jkb等。常用PCR2序列特异性引物（SSP）技术、等位基因特异PCR（AS2PCR）、PCR2限制片段长度多态性（RFLP）方法等。对于有HDN史或流产史的妇女，如果其丈夫的血型基因为杂合子基因，分子生物学技术可以更早、更准确地预测出胎儿的血型基因型，以预测胎儿是否会发生HDN。近年来，许多国家已经开始普及无创胎儿Rh基因型检测方法，即从孕妇外周血血浆中检测游离的胎儿Rh基因型。针对要检测的血型基因型设计引物和探针，从孕妇血浆中萃取DNA，进行实时定量PCR检测，如检测出与孕妇血型不合的基因型，则说明此胎儿发生HDN的风险比较高，如果未检测出，则可排除HDN的风险。以往建议在孕16周时做基因诊断，现有专家主张植入前诊断，即如果对丈夫血型基因为杂合子基因，对可能孕有或已有过HDN胎儿的高危育龄妇女，采用体外受精，在发育到6-8个细胞期时，在显微操作下活检单卵裂球细胞，进行基因分析，选取缺失致HDN等位基因的胚胎植入母体内，从而避免HDN。

四、出生后诊断

（一）血清学检测

直接抗人球蛋白试验、游离抗体检测、抗体释放试验是最经典、最特异的HDN血清学检测方法，其中以抗体释放试验价值最高，诊断新生儿溶血病最有力的证据是证实患儿红细胞被来自母亲的IgG血型抗体所致敏。

1、标本的留取

临床怀疑为新生儿溶血病时，送免疫血液学实验室的标本要求较高。要求采集新生儿的血液4-5ml，分为大约相等的两份，一份不抗凝，另一份用ACD保存液或EDTA抗凝。必要时采集母亲的血液4-5ml，其中分出0.5ml加抗凝剂。必要时采集父亲的血液0.5ml，加抗凝剂保存备用。

新生儿标本难以采集，要尽可能用送来的标本做好实验。如采集来的是抗凝标本，注意保留血浆备用；如采集来的是不抗凝标本，用分离血清后的血块做红细胞悬液。用血块制备的红细胞悬液做直接抗球蛋白试验时用抗IgG试剂而不用广谱抗球蛋白试剂。脐血标本不宜作为检测标本，尤其对ABO新生儿溶血病，容易出现无临床意义的阳性指标。新生儿出生5天以后采集的血样，检出阳性指标的机会较低。

2、直接抗人球蛋白试验（直抗）

如果新生儿红细胞被IgG抗体所致敏，直抗可能为阳性，说明新生儿红细胞被IgG抗体致敏，但还不能诊断为HDN，该抗体的特异性需要进一步检测证实。由于新生儿的A（B）抗原密度较低，所以被结合的抗体也很少，导至ABO系统HDN直抗通常为阴性或弱阳性。其他系统的HDN直抗结果通常比较强，但个别ABO系统HDN直抗也可以表现为强阳性，是否由于个体差异还有待研究。如果Rh系统和其他系统HDN已采取宫内治疗，生后直抗可为阴性或弱阳性。

3、血型鉴定

血型鉴定与游离抗体试验和释放试验相结合，可用来判断或证实其结果。直抗阴性或弱阳性的新生儿红细胞血型鉴定并不困难，如果新生儿红细胞直抗呈强阳性，则会影响血型鉴定，这时需采用多种方法排除假阴性和假阳性结果。通常自身对照可发现假阳性结果，用热放散后的红细胞做血型鉴定可排除假阴性结果。

4、游离抗体试验

游离抗体试验是检查新生儿血清中是否存在与其红细胞不配合的IgG血型抗体，ABO系统外的HDN血清来源可以是脐带血或者母亲血清。检出的IgG抗体需要证实能够与患儿红细胞反应，才能判定游离抗体试验阳性。游离抗体试验只能确定患儿血清中存在与其红细胞不配合的血型抗体，还不能证实其红细胞受到该抗体致敏，需要结合直抗或释放试验才能诊断HDN。

5、释放试验

提取致敏于新生儿红细胞表面的抗体到放散液中，用放散液与相应的酶处理A、B、O红细胞或一组谱细胞反应，以确定放散液中抗体的特异性。释放试验是血清学检测中最有价值的一项试验，即使直抗和游离抗体试验均阴性，仅凭释放试验阳性即可以诊断HDN。游离抗体试验和释放试验的反应强度与HDN的严重程度无直接关系，这是因为HDN的严重程度受抗体浓度以外的多种因素影响。有文献报道，血清中IgG1和IgG3阳性时，高胆红素血症的发生率明显升高，IgG3阳性时高胆红素血症的发生率更高，胆红素水平也显著增高。

血清学检测的阳性率受检测时间的影响很大，有文献报道，送检越早，检测阳性率也越高，这是因为随发病时间的延长，患儿血液中的游离抗体和致敏红细胞越少，大部分血型抗体以抗原抗体复合物形式存在，失去免疫反应性，导至检出阳性率降低。所以建议尽早送检，以达到早期诊断、早期治疗的目的，如果能得到脐带血更有助于HDN的早期诊断。血清学检测特异度较高，但敏感度较低，微柱凝胶技术是一种改良的血清学实验方法，利用一定的技术获得易于保存的多价抗人球蛋白，将传统的抗人球蛋白实验方法和微柱凝胶分子筛查相结合，能够捕捉到传统实验方法无法检测到的微弱抗原抗体反应，提高HDN诊断敏感度。一旦血清学检测阳性应及早采取措施和监测病情，有些HDN患儿虽然早期没有明显临床表现却可发生晚期贫血，这可能与患儿脾功能发育程度有关。

（二）血清胆红素及网织红细胞（RC）检测

由于血清学检测的敏感度比较低，所以应早期检测血清胆红素并进行监测，及早发现黄疸并治疗。检测6小时龄血清胆红素，并以6814μmol/L和10216μmol/L为临界值，可预测几乎所有明显黄疸，尤其是严重HDN。小时特异性胆红素百分位点图可用于预测患儿发生严重黄疸的危险率。高危患儿胆红素值大于第90个百分位，中危患儿胆红素值在第35-90个百分位之间，低危患儿胆红素值小于第35个百分位。6小时龄第35和90百分位点相对应血清胆红素为5614μmol/L和11112μmol/L。RC与溶血程度的相关性较差，其取决于抗体类型（Kell抗体免疫的新生儿，RC不升高）、骨髓反应活性、采血时间（在溶血高峰与骨髓反应有一个延迟期），并且需要排除其他类型的贫血，因此RC只能作为诊断HDN的参考指标。

（三）细胞学方法

细胞学方法通过检测巨噬细胞的吞噬能力，可以推测溶血发生的严重程度，在产前诊断与出生后诊断均适用，产前用于判断HDN发生的可能性以及严重程度，出生后用于判断临床发展及预后。在早期诊断ABO HDN方面，细胞学方法较抗体效价测定更为灵敏和准确。现常用的细胞学方法有：单核细胞单层分析法（MMA）、抗体依赖细胞毒试验（ADCC）、化学发光试验（CLT）。ADCC因为存在放射污染，临床应用不多，MMA和CLT应用比较多，尤其CLT现有化学发光仪，可以简化操作步骤。Kell抗体所致的HDN严重程度与抗体效价相关不大，胆红素和RC升高也不明显或者在正常水平，贫血常发生在出生两周以后。这是因为Kell抗原较早的表达在祖红细胞上，抗体致敏的K+祖红细胞被吞噬细胞免疫破坏，从而导至造血抑制。因患儿红细胞可不被抗2K致敏，所以此种病例依靠细胞学诊断。抗2Ge所致的HDN与抗2K发病机制相同。

（四）内源性一氧化碳（CO）的检测

血红蛋白降解时产生的胆红素与CO摩尔数相同，80%-90%的内源性CO由红细胞破坏产生。呼气末CO浓度（ETCO）与溶血程度直接相关，可以用气相色谱法检测，敏感度和特异度均较好。呼气末CO斯达分析仪可以测定呼吸中的ETCO，并与环境中的CO校正，几分钟内完成，且无创伤，受到临床的欢迎。其适用人群为：健康（败血症患儿但情况比较好的不排除在外）足月适于胎龄儿，并且要家属同意。需注意，孕妇吸烟影响新生儿出生后48-72h的ETCO值。

五、临床意义

新生儿溶血病（HDN）也是由于母亲体内存在与其胎儿红细胞不配合的IgG性质的不规则抗体，引起同种被动免疫性疾病。凡是以IgG性质出现的不规则抗体，理论上都可以引起HDN，因为IgG性质抗体能通过胎盘进入胎儿血循环，破坏胎儿红细胞，引发胎儿水肿、黄疸、贫血和肝脾肿大，甚至并发核黄疸。因此对有输血史或妊娠史的孕妇也应作不规则抗体筛选，若检测出不规则抗体，应做出相应的预防和治疗。Rh血型中D抗原的抗原性强于E抗原的抗原性，因此产生抗D抗体的几率大于抗E抗体。抗A1抗体为A亚型中不规则抗体，它的存在提示我们在注意ABO血型以外的不规则抗体的同时，也应高度重视ABO亚型中的不规则抗体，因为它也是引起溶血性输血反应的一个因素。抗M抗体为冷凝集素，很少在37℃有活性，一般在体内不能引起溶血反应，但患者处于低温麻醉状态下手术时应注意，因为此类抗体可激活补体。当机体的体温在冷抗体最适反应温度范围内（4-20℃）时，可发生溶血反应。

不规则抗体产生大多为Rh血型系统，除抗D外，其他如抗E，抗Ec，抗Ce检出率占Rh系统67.8%，提示Rh阳性患者输血也可引起溶血反应，且机率较高。据我国汉族人群Rh抗原分布特点，E抗原阳性比D抗原阳性低，产生抗E抗体的机率高于抗D抗体，故Rh血型系统D抗原阳性E抗原阴性者输血不容忽视。Rh阴性个体免疫后产生抗D的机率为70.9%，产生的抗体其效价在体内会逐渐下降，甚至常规试验会漏检，若以后作为受血者输入Rh（D）阳性血刺激时，会很快出现免疫性回忆反应。抗体效价会在1-2周内达到高峰，引起迟发性血管外溶血，且发生在输血后几天，造成输血无效及溶血，易被临床忽视。溶血反应的强度与抗体效价成正比关系，抗体产生的强度增加溶血反应愈严重。抗M、抗Lea、抗P1均较少见，但抗Lea抗体可引起严重的溶血性输血反应，所以不能作为供血者，如为受血者时应给Le（a-b-）血液输。抗M抗体只有37℃或抗球蛋白试验出现阳性时才具有临床意义。抗P1最理想的反应温度为4℃，偶可在37℃查出。抗P1抗体很少在体内造成溶血，几乎总是IgM型抗体，所以不能通过胎盘，不会造成HDN。冷凝集素在配血时可忽略。自身抗体在自身溶血性贫血时出现较多，一直以来是输血的一大难题，仍遵循一般输血原则。

综上所述，评估HDN的发生，应结合妊娠史、流产史、HDN史、孕妇抗体效价动态水平、羊水穿刺术以及抗体功能活性测定，测定母体抗体潜在的细胞溶解活性，以预测HDN的发生并提高预测准确性。将从孕妇外周血分离胎儿基因型技术应用到临床，可为HDN的产前诊断提供安全、准确而有效的依据。出生后尽早进行胆红素、血清学方法、RC计数、内源性CO检测，结合临床表现，做到早期诊断，早期干预，将病情尽早控制。