免疫细胞化学在细胞诊断中的应用

检验医师

一、概述

免疫细胞化学常称为免疫组织化学（简称免疫组化）是利用免疫反应以定位组织中某类抗原成分分布的一门新兴技术。借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。利用显微镜的精确性与抗原抗体反应的敏感性相结合的方法，就发展成一门崭新的学科。免疫组化的发展仅40 多年，直到近10 多年才发展迅速，被广泛用于外科病理学及其他研究领域。

免疫组化在外科病理中应用广泛，主要检测细胞内或细胞间的正常或异常产物，以确定某些肿瘤的组织发生及类型，以及估价免疫损伤性疾病的性质、发病机制和预后。免疫球蛋白及T 细胞表面标志检测；内分泌激素的检测；肿瘤相关抗原的检测和细胞内酶或其他标志的检测等。上述诸方面免疫组化亦在细胞学领域应用或开始探索。

二、免疫细胞化学的原理

应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。因此可将此技术分为三个部分或三个系统，即识别系统、联结系统和显示系统。

识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。

显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。

三、免疫细胞化学的方法

免疫酶标记法是最常用于免疫细胞化学的方法，又分为直接法和间接法、酶! 抗酶法、卵白素—生物素复合物法以及标记的链霉卵白素! 生物素法等。按不同的抗原可在涂片、冰冻切片及石蜡切片等标本上采用。

1. 直接法

直接法中，使用了酶标记的抗体，将此抗体与细胞中的抗原作用，就会发生抗原抗体结合反应，经显示系统作用，即可在靶抗原存在部位形成有色沉淀。此方法操作省时、简单，背景着色浅，但要求有较高的抗原含量，因此仅适用于新鲜标本的染色。每染一种抗原就需要一种标记抗体，手续相当烦琐。

2.间接法

直接法和间接法的区别在于后者染色时使用了两种抗体。第一种为针对靶抗原的特异性抗体，第二种是标记的针对第一抗体的抗体。当第一抗体滴加到标本上，它将与靶抗原结合。尔后经标记的第二抗体与第一抗体结合，经显色而显示出抗原存在的部位。第二抗体应来自与第一抗体不同种的动物。目前常用的抗体通常来自少数几种动物，因此只要用少数标记的第二抗体就可以与全部第一抗体匹配。最常用的第一抗体来自兔，只要有一个羊抗兔的标记抗体就可以配用新有的兔的第一抗体，但间接法较之直接法耗时较长，更有可能出现非特异性背景着色。

3. 酶- 抗酶方法（PAP 法）

酶抗酶方法是一种非标记的方法，共需要三种试剂：针对靶抗原的第一抗体；称之为“桥”的第二抗体，其作用是以其二“臂”，一边与第一抗体结合，另一边与PAP 复合物结合，而将二者连接到一起，第三抗体即PAP 复合物，是用辣根过氧化酶免疫动物，待抗体形成后，收集并提纯抗体，再与辣根过氧化酶混合作用，形成的抗原抗体复合物。其作用是通过与第二抗体结合，将酶带到靶抗原位点。一个PAP 由三分子酶和二分子抗体形成，此方法的要点在于第一抗体和PAP 复合物必须是同种动物的同型抗体，这样才能分别与第二抗体的两个结合位点相结合。

因为标记是一个化学过程，标记常使抗体和酶的效价降低。因PAP 复合物可携带更多的酶且未经标记，因此其灵敏度比标记方法高得多。更有用酶标记PAP 复合物中的抗体的方法来增加敏感度。近年来有作者用碱性磷酸酶代替辣根过氧化酶，形成碱性磷酸酶- 抗碱性磷酸酶复合物，亦得到很好的结果。尤其在双抗原标记中效果更佳。由于PAP 法异常敏感，对在福尔马林固定，石蜡包埋过程中抗原损失较多的标本更为适用。改良后的双桥PAP 法较PAP 法更为敏感。

4. 卵白素- 生物素复合物法（ABC 法）

ABC 法是以生物素—卵白素—酶复合物作为标记体系的免疫组化方法。卵白素是一种68kD 的糖蛋白，具有四个与维生素—生物素结合的位点，二者间的亲和力既高且具特异性，均用于标记抗体或酶。此方法中有三种主要试剂：特异性第一抗体；生物素化的第二抗体；亚饱合的生物素—卵白素复合物（即复合物中还留有一个生物素的结合位点）。

如采用生物素化的第一抗体，则经二步即可完成染色。ABC 法至少具有与PAP 相同的灵敏性，其染色过程大体与PAP 法相似。但对某些特殊部位含有较多的内源性生物素的组

织，如肝、肾细胞，应以两滴卵白素封闭之。ABC 复合物需新鲜配制，保存不应长于3 天。现亦可用碱性磷酸酶等其他酶类标记生物素用于双抗原标记染色。

5. 标记的链霉卵白素- 生物素法（LSAB）

80年代开始采用LSAB 法，其优点在于快速，且更为敏感，全过程可在1 小时内完成可采用高稀释度的第一抗体，其非特异性的背景染色很淡。

此方法是标记的卵白素技术，基本试剂有三：1)第一抗体；2)生物素化第二抗体；3)辣根过氧化酶标记的链霉卵白素。在ABC 法中，ABC 复合物是一个大三维结构，移动慢，不易与深在位点相结合。而标记的链霉卵白素分子量很小，可以快速移动，能与深在位点相结合，敏感性很高，非特异性背景染色淡。ABC 复合物很大，携带很多酶，一旦发生非特异性吸附，将有较强的信号，而标记的卵白素较小，携带酶少，即使发生吸附，信号也将较弱。链霉卵白素结构上荷电位点少于一般卵白素，不易发生吸附，因此，LSAB 是一种较优越的方法。

6. 双染色技术

双染色技术已经发展得很完善。可以从同一切片上甚至同一细胞中同时显示两种不同的抗原。最初主要是用异硫氰酸荧光素和罗丹明标记两种抗体进行双染色。不同的靶抗原由不同抗体标记而在荧光镜下显示绿色或红色荧光。随着免疫酶技术的发展，可用两套由不同酶标记的抗体着染两种不同的靶抗原。方法为先以第一套抗体、继而用第二套抗体着染切片。不同的标记酶例如辣根过氧化酶和碱性磷酸酶的应用，克服了相同的标记酶和抗体间的交叉反应。

7. 对照设置和染色结果分析

为了证明染色是否成功和结果是否可靠，应建立包括阴性对照、阳性对照和吸收试验的对照系统。

阴性对照：阴性对照染色中的第一抗体由!"# 或无关抗体取代，其他全过程同靶抗原染色。如果靶片阳性而对照阴性，证明染色有效；如果对照出现着色，则染色无效。

阳性对照：应用已知阳性的标本作为阳性对照。如果阳性对照的抗原存在部位得到清晰的阳性结果证明染色成功。

吸收试验：吸收试验是最可靠的检测方法。以过量抗原与第一抗体混合，抗原抗体将结合而形成抗原抗体复合物沉淀。用吸收过的抗体染色切片作为对照，如未吸收的抗体染色阳性，而吸收过的抗体染色阴性，则染色有效；如吸收过的抗体着染，则染色无效。

（转自 病理世界）