甲型和乙型流感病毒（完整版）

检验医师

流感病毒是仅有的可以在全球范围内对所有年龄段造成突发性普遍疾病的病毒。在过去的一个世纪中曾经发生过三次与病毒表面糖蛋白（HA，NA）“ 变异”相关的“流行病”。其中，发生在1918年的“西班牙流感”造成了全球超过2千万人死亡，并且死者主要是青壮年。每年流感流行与不同的病毒类型或亚型有关，可以导至大量的发病率和死亡率，尤其是在高风险组。尽管流感有特有的临床症状，如突然发热（＞38°C），明显的中毒症状（头痛，肌痛），干咳，呼吸急促和胸骨疼痛等，但是根据年龄不同，个人的免疫状态不同，伴随着人的病毒株的致病性及病理学特征不同，临床表现也不尽相同。随着实验室测试应用的发展，在流感流行前或者流行过程中进行诊断的手段得以实现。流感的实验室诊断是基于直接检查和配对血清标本的血清学检测。免疫荧光（IF）可以用于直接对鼻咽分泌物进行测试。EIA测试一般是比较客观的，并且比IF直接检测更敏感。这些诊断对于针对病因的治疗处方是非常必要的。

甲型和乙型流感病毒属于正粘病毒科，含八段单链RNA，呈球形（直径30-100nm）。流感病毒的核蛋白（NP）抗原与病毒RNA的特异性相关，根据NP的不同流感病毒可以分为甲乙丙三种类型。另外两个重要的抗原是血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），二者都是糖蛋白，决定流感病毒的亚型。

所有的流感病毒抗原的工艺相似。来源是接种了相应病毒株的10-12日龄鸡胚尿囊液。尿囊液通过低速离心澄清，病毒通过在SW 27转子（贝克曼）高速离心1h分离沉淀。再经过两个连续的超速离心进一步纯化病毒。然后再经过蔗糖密度梯度离心后，收集病毒带，用STE缓冲液稀释，最后通过超速离心1h沉淀。

为确保病毒的稳定性，病毒以高浓度保存在-20℃。免疫反应是用内部ELISA测试的，使用针对甲流和乙流的单克隆抗体，抗原滴度从1:5000至1:10000。在MDCK培养的感染性测试呈阴性。甲型和乙型流感病毒抗原在特异性IgG、IgM和IgA抗体血清学试验有很好的表现，也包含EIA检测。我们也推荐这些病毒抗原用于多克隆抗体的制备。

1. 甲型流感抗原

HyTest 可以提供如下甲型流感抗原：

Influenza A (H1N1) virus, strain A/Taiwan/1/86

Influenza A (H1N1) virus, strain A/Beijing/262/95

Influenza A (H1N1) virus, strain A/New Caledonia/20/99 (见图 1.)

Influenza A (H1N1) virus, strain A/Solomon Islands/03/06

Influenza A (H3N2) virus, strain A/Shangdong/9/93

Influenza A (H3N2) virus, strain A/Panama/2007/99 (见图 2.)

Influenza A (H3N2) virus, strain A/Kiev/301/94

Influenza A (H3N2) virus, strain A/Wisconsin/67/05

Influenza A (H3N2) virus, strain A/Brisbane/10/07

来源是接种相应甲型流感病毒的10-12日龄鸡胚尿囊液。纯化的病毒用硫柳汞和β-丙内酯处理灭活。所有产品纯度大于90%，这些抗原可用于ELISA，HIT以及WB平台检测甲型流感病毒抗体。

甲型流感（H1N1）抗原在ELISA实验中与H3N2的单克隆抗体没有交叉反应，同时甲型流感（H3N2）抗原在ELISA实验中与H1N1的单克隆抗体也没有交叉反应。并且这些抗原与乙型流感的HA单抗和NP单抗均无交叉反应，在凝血抑制实验中与甲流和乙流的不同亚型的抗血清也无交叉反应（见表1）。

2. 甲型流感单克隆抗体

HyTest可以提供高灵敏度和高特异性的单克隆抗体用于甲型流感病毒的检测。甲型流感单克隆抗体可用于常规的免疫试验（直接或间接ELISA, 夹心免疫检测系统，Western blotting）测试不同生物样本（鼻咽分泌物，细胞溶解物等）中最重要的特异性流感抗原如血凝素（HA）和核蛋白（NP）。这些单克隆抗体与乙型流感病毒没有交叉反应，所以可用来区分甲型和乙型两种流感。

2.1. H1和H3单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：从尿囊液提纯的甲型流感H1N1或H3N2

特异性：血凝素H1

提纯方法：蛋白A或蛋白G亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

杂交瘤细胞克隆株来源于杂交的Sp2/0骨髓瘤与Balb/c小鼠脾细胞，后者经纯化甲型流感病毒A/New Caledonia/20/99 (strain H1N1) 或 A/Shangdong/9/93 (strain H3N2)免疫。血凝素特异性抗体可在ELISA和Western blotting实验中选择性检测甲型流感凝集素H1或H3。

2.1.1. 甲型流感H1和H3 ELISA 检测

抗血凝素的单克隆抗体可以在直接或间接ELISA中特异性检测甲型流感病毒。图3为单克隆抗体 InA4（H1特异性）和单克隆抗体 InA246（H3特异性）的滴定曲线。

单克隆抗体 C102（图4）的免疫原取自于甲型禽流感病毒（H1N1）,它直接作用于相对保守的H1抗原表位。该单克隆抗体的交叉反应模式表明它不会与H3及其他血凝素反应，只与源自人或禽流感病毒的H1发生反应，其间接ELISA滴度不少于1:128000。因而，单克隆抗体C102可用于EIA检测，以区别不同病毒亚型。同样，它也可用于免疫细胞化学试验，血凝抑制试验和免疫荧光试验。

2.1.2. 甲型流感定量夹心免疫试验

所有的单克隆抗体都在夹心荧光免疫分析中分别作为捕获抗体或检测抗体进行了测定。筛选出的抗体对可以高特异性和高灵敏度的检测甲型流感病毒的特异毒株。纯化的甲型流感病毒毒株（H1N1和H3N2）与重组的H1和H3均作为抗原进行了测试。我们推荐以下配对用于特异性检测甲流H1免疫测定（捕获抗体-检测抗体）：

InA4 - InA88

InA4 - InA134

InA97 - InA134

所有抗体对都可以检测病毒或者重组血凝素H1，并可用于甲型流感H1Nx的免疫检测系统。其中一对单克隆抗体的校准曲线见图5。

2.1.3. 甲型流感 H1和 H3 Western-blotting 检测

血凝素H1或H3经还原性SDS-PAGE电泳后在Western blotting中可被所有单抗检测。单克隆抗体可以结合加工或非加工的血凝素的HA1链。特异性抗体免疫检测甲型流感血凝素见图6。

2.2. 抗甲型流感血凝素H2单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：从尿囊液提纯的甲型流感H2N2

特异性：血凝素H2

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

杂交瘤细胞克隆株来源于杂交的Sp2/0骨髓瘤与Balb/c小鼠脾细胞，后者免疫了纯化后的甲型流感病毒A/Japan/305/57（H2N2病毒）。血凝素特异性抗体，可在EIA中选择性的检测甲型流感 H2血凝素。

2.2.1. 甲型流感 ELISA检测

所有单克隆抗体可以通过直接或间接ELISA试验检测出甲型流感病毒的血凝素H2，部分H2特异性单克隆抗体（InA320和InA387）的典型滴定曲线见图7。

我们对所有单克隆抗体与其它甲流病毒的交叉反应也进行了测定。交叉反应测试包括如下病毒：甲型流感 H1N1 (strain A/New Caledonia/20/99), 甲型流感 H2N2 (strain A/Japan/305/57), 甲型流感H3N2 (strain A/Panama/2007/99), 甲型流感 H7N7(strain A/Netherlands/219/03) 和副流感病毒(type1 Sendai)。

单克隆抗体InA317, InA318, InA320，InA382与上述检测的其他甲型流感病毒无交叉反应（单克隆抗体InA320和InA387的代表性交叉反应见图7）。只有单克隆抗体InA264和InA382与甲型流感H1N1发生交叉反应（数据未显示）。

2.2.2. 甲型流感 H2 Western-blotting 检测

血凝素H2经还原性SDS-PAGE电泳后在Western blotting中可被所有单抗检测。

特异性抗体免疫检测甲型流感血凝素见图8。

2.3. 抗甲型流感血凝素H5单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：提纯的甲型禽流感病毒（H5N1）

特异性：血凝素H5

提纯方法：蛋白G亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

禽流感病毒自然产生于鸟类之间，并可引起禽流感感染。通常所说的“禽流感”主要是指发现于鸟类之间的甲型流感病毒，但这种病毒也可以感染人类。禽流感在100年前的意大利流感大爆发中被首次确认。之后，这一疾病在世界范围内无规律的不断发生。

甲型流感病毒有很多不同的亚型，它们的不同是因为甲型流感病毒表面某些特定蛋白发生了改变（血凝素[HA]和神经氨酸苷酶[NA]）。HA和NA可以任意结合，且每种结合都是一种不同的亚型。在16种不同血凝素类型中，只有包含H5和H7亚型的病毒会引发禽流感，它们具有高度传染性并可快速致死。如果高致病性的流感H5病毒爆发，家禽的死亡率常常高达90%-100%。

2.4. 抗甲型流感血凝素H7单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：从尿囊液提纯的甲型流感H7N7或H7N1

特异性：血凝素H7

提纯方法：蛋白A或蛋白G亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

杂交瘤细胞克隆株来源于杂交的Sp2/0骨髓瘤与Balb/c小鼠脾细胞，后者经纯化后的甲型流感病毒Influenza A/Netherlands/219/03（H7N7病毒）免疫。血凝素特异性抗体，可通过多种免疫方法选择性的检测甲型流感H7血凝素，如直接或间接ELISA，夹心免疫检测等。

2.4.1. 甲型流感 ELISA 检测

所有单克隆抗体可以通过直接或间接ELISA检测出甲型流感H7血凝素。抗血凝素H7单克隆抗体InA334的典型滴定曲线见图9。

我们对所有单克隆抗体与其它甲流病毒的交叉反应也进行了测定。交叉反应测试包括如下病毒：甲型流感 H1N1 (strain A/New Caledonia/20/99), 甲型流感 H2N2 (strain A/Japan/305/57), 甲型流感H3N2(strain A /Panama/2007/99), 甲型流感 H7N7 (strainA/Netherlands/219/03) 和副流感病毒(type 1Sendai)。

已经得到证实的是，所有单抗对甲型流感H7病毒具有高度特异性且它不会与测试中的其他甲型流感病毒结合（单克隆抗体InA334的典型交叉反应见图9）。

2.4.2. 甲型流感 H7定量夹心免疫试验

所有的单克隆抗体都在夹心荧光免疫分析中作为捕获抗体或检测抗体进行了测定。筛选出的抗体对可以高特异性和高灵敏度地检测甲型流感血凝素H7。纯化的甲型流感病毒Influenza A/Netherlands/219/03 H7N7和重组的H7均在夹心荧光免疫实验中作为抗原。推荐用于特异性检测甲流H7免疫测定的配对抗体（捕获抗体-检测抗体）：

InA334 – InA331

InA334 – InA414

所有推荐的抗体对都可以检测甲流H7N7病毒或者重组血凝素H7。其中一对单克隆抗体的校准曲线见图10。

2.5. 抗甲型流感血凝素H9单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

抗原：重组H9

特异性：血凝素H7

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

杂交瘤细胞克隆株来源于杂交的Sp2/0骨髓瘤与Balb/c小鼠脾细胞， 后者经甲型流感H9N2病毒（A/Chicken/Hong Kong/G9/97 和 A/Hong Kong/1073/1999）的重组H9血凝素免疫。

2.5.1. 甲型流感 ELISA 检测

所有单克隆抗体可以通过直接或间接ELISA检测出血凝素H9。InA370的滴定曲线见图11。

我们对所有单克隆抗体与其它甲流病毒的交叉反应也进行了测定，包括：甲流H1N1 (strain A/New Caledonia/20/99)，甲流H2N2 (strain A/Japan/305/57) 甲流H3N2 (strain A/Panama/2007/99),甲流H7N7(strain A/Netherlands/219/03), 副流感病毒 (type 1Sendai)。单抗InA370和InA346与其他的甲流病毒无交叉反应。InA355与H1N1和H2N2有部分交叉反应（数据未显示）。

抗体InA355和InA370对于病毒A/Chicken/HongKong/G9/97和A/Hong Kong/1073/1999的结合性能相同。抗体InA346在直接或间接ELISA中对于A/Chicken/Hong Kong/G9/97的结合能力弱于A/Hong Kong/1073/1999，但是在夹心免疫试验中，它可以作为检测所有H9病毒的检测抗体（见图12）。

2.5.2. 甲型流感H9定量夹心免疫检测

所有的单克隆抗体可以在夹心荧光免疫中检测出H9抗原。推荐用于特异性检测甲流H9免疫测定的配对抗体（捕获抗体-检测抗体）：

InA355-InA370

InA355-InA346

这两对抗体都可以检测病毒血凝素H9和重组血凝素H9，并具有很高的灵敏度（见图12）。

H9配对抗体与其他甲流病毒的交叉反应检测显示抗体对与如下病毒无交叉反应：甲型流感 H1N1 (strain A/New Caledonia/20/99),甲型流感 H2N2 (strain A/Japan/305/57),甲型流感 H3N2 (strain A/Panama/2007/99)和甲型流感 H7N7 (strain A/Netherlands/219/03)（图13）。

2.6. 抗甲型流感基质蛋白M2单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

抗原：提纯的甲型流感病毒

特异性：甲型流感病毒的基质蛋白M2

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

2.7. 抗甲型流感非结构性蛋白（NS）单克隆抗体

该单克隆抗体是以甲型流感H5的非结构性抗原作为免疫原生产的。可用于ELISA或其它方法检测抗原，或者通过竞争ELISA方法筛选抗体等。

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

抗原：提纯的甲型流感病毒

特异性：甲型流感病毒的基质蛋白M2

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

2.8. 抗甲型流感核蛋白（NP）单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

抗原：提纯的甲型流感病毒H1N1

特异性：单抗可与核蛋白发生反应，常见于甲流病毒H1N1，H3N2和其它甲流病毒

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

HyTest有许多用于检测甲流病毒的抗核蛋白（NP）单克隆抗体。免疫原为甲型流感病毒H1N1。

所有这些抗体可以高特异性的检测出甲型流感的核蛋白且不会与乙型流感核蛋白发生交叉反应。

我们对F8单克隆抗体特异性研究表明它可以识别表达在核蛋白上的保守型表位，后者常见于具有不同抗原结构和种类起源的甲型流感病毒。我们对25组来自人和禽的甲型流感病毒（分别来自从1934到1993不同时段的不同瘟疫）进行检测，所有测试都有特异性反应发生。我们又通过直接免疫荧光的方法检测了265个取自流感爆发期间儿童患者的鼻分泌物，结果显示NP抗体对甲型流感的敏感性和特异性分别为60%和98.2%。

2.8.1. 甲型流感NP的ELISA检测

我们用抗核蛋白单克隆抗体对不同亚型的甲型流感进行检测。单克隆抗体InA108的滴定曲线见图15。

2.8.2. 甲流NP Western Blotting 检测

甲流病毒的NP经还原性SDS-PAGE电泳后在Western blotting中可被InA108和InA245检测。

抗核蛋白的单克隆抗体InA108对甲型流感NP的免疫检测结果见图16。

2.8.3. 甲型流感核蛋白定量夹心免疫检测

所有的单克隆抗体都在夹心荧光免疫分析中作为捕获抗体或检测抗体进行了测定。筛选出的抗体对可以对H1N1和H3N2的核蛋白具有等同的检测能力。抗甲型流感结构蛋白抗体的最佳配对为（捕获抗体-检测抗体）：

InA108 – InA245

InA180 – InA245

所有的抗体对都可以检测甲流病毒的不同毒株。其中一对单克隆抗体的校准曲线见图17。

3. 乙型流感抗原

HyTest 可以提供如下乙型流感抗原：

Influenza B virus, strain B/Tokio/53/99 (见图19.)

Influenza B virus, strain B/Victoria/504/00 (见图20.)

Influenza B virus, strain B/Malaysia/2506/04

Influenza B virus, strain B/Florida/07/04

Influenza B virus, strain B/Florida/04/06

来源是接种适当乙型流感病毒的10-12日龄鸡胚尿囊液。纯化的病毒用硫柳汞和β-丙内酯处理灭活。所有产品纯度大于90%，这些抗原可用于ELISA，HIT以及WB平台检测乙型流感病毒抗体。

乙型流感抗原在ELISA实验中与甲型流感H3N2和H1N1的单克隆抗体没有交叉反应，并且在凝血抑制实验中与甲流H3N2和H1N1的抗血清无交叉反应（见表2）。

4. 乙型流感单克隆抗体

HyTest可以提供特异性识别乙型流感病毒的核蛋白、血凝素和基质蛋白M1的单克隆抗体。这些单克隆抗体具有高度亲和性和特异性，可在直接或间接ELISA,夹心免疫检测系统和Western blotting中使用。

抗核蛋白的单克隆抗体对乙型流感病毒核蛋白具有高度特异性，不会与甲型流感病毒核蛋白或其它病毒蛋白反应。其低检测限使得它们可以检测不同样本中的低效价乙型流感病毒。由于高特异性和高亲和性，它们被推荐用于乙型流感快诊测试。

抗血凝素的单克隆抗体可以特异性的与乙型流感血凝素HA2发生反应，对乙型流感病毒的不同毒株具有同等检测效应。

抗基质蛋白的单克隆抗体对乙型流感病毒的基质蛋白M1具有高度的敏感性，它可以通过EIA或Western blotting检测出不同乙型流感病毒种类的M1。

4.1. 乙型流感核蛋白（NP）单克隆抗体

宿主动物：小鼠SJL/J（2/3单克隆抗体）,小鼠Balb/c（其它）

融合用细胞系：Px （ 2/3的单克隆抗体）, Sp2/0 （其它）

抗原：提纯的乙型流感病毒

特异性：乙型流感病毒的核蛋白

提纯方法：蛋白G或蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

4.1.1. 乙型流感 ELISA 检测

所有抗核蛋白的单克隆抗体可以在直接或间接ELISA中检测出乙型流感的不同病毒种类。

其中一株单克隆抗体InB114的滴定曲线见图21。

4.1.2. 乙型流感定量夹心免疫检测

所有的单克隆抗体都在夹心免疫实验中分别作为捕获抗体或检测抗体进行了测定。筛选出的配对抗体与所有检测的乙流病毒具有同样的特异性和高灵敏度。测试中所用抗原为乙型流感的不同病毒种类(Influenza B/Leningrad/ 86/93, Influenza B/Tokyo/53/99,Influenza B/Victoria/ 504/00)和重组的乙型流感病毒核蛋白。推荐乙型流感NP特异性免疫检测的抗体配对为（捕获抗体-检测抗体）：

InB12 – InB27

InB12 – InB64

InB36 – InB64

所有推荐的配对抗体都可用于乙型流感的免疫检测系统。其中一对单克隆抗体的校准曲线见图22。

单克隆抗体可特异性的对核蛋白分子的不同片段反应。选择针对不同抗原表位的单克隆抗体可以使NP免疫检测具有更高的灵敏度。所有单克隆抗体的表位特异性见表3。

4.1.3. 乙型流感病毒的 Western blotting 免疫检测

乙型流感核蛋白（NP）经还原性SDS-PAGE电泳后在Western blotting中可被所有单抗检测。其中一个抗体对乙型流感病毒核蛋白（NP）的免疫检测结果见图23。

4.2. 抗乙型流感血凝素（HA）单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：提纯的乙型流感病毒

特异性：特异性结合乙型流感病毒血凝素HA2

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

4.2.1. 乙型流感病毒HA的ELISA免疫检测

所有的抗血凝素单克隆抗体可以通过直接或间接ELISA

试验同等的检测出乙型流感病毒不同毒株的血凝

素。单克隆抗体InB190的滴定曲线见图25。

4.2.2. 乙型流感 HA Western blotting 免疫检测

乙型流感病毒血凝素的HA2链经还原性SDS-PAGE电泳后在Western blotting中可被所有单抗检测。

4.3. 抗乙型流感基质蛋白M1单克隆抗体

宿主动物：小鼠Ba1b/c

融合用细胞系：Sp2/0

免疫原：提纯的乙型流感病毒

特异性：乙型流感病毒的基质蛋白M1

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于含0.1%叠氮化钠的PBS

4.3.1. 乙型流感基质蛋白M1 ELISA检测

在直接和间接ELISA中用InB4和InB15检测乙型流感基质蛋白M1。其中一个单抗的滴定曲线见图27。

4.3.2. 乙型流感基质蛋白M1 Western blotting 检测

在还原性SDS-PAGE Western blotting 中，所有的单克隆抗体均可以检测乙型流感基质蛋白M1。InB4和InB15 对不同亚型的乙型流感病毒M1蛋白的检测能力相同。

来源：Hytest