实验室检测和诊断HIV感染的标准

检验医师

作者：北京协和医学院研究生院 康凤凤 、胡丽涛

    卫生部北京医院卫生部临床检验中心 王治国

HIV诊断试验有两个主要目的：

1）验证出现HIV感染体征或症状的个体是否是真正感染；

2）确定接触过HIV但无症状的个体的HIV感染状态。及时发现HIV感染者至关重要，这不仅可适时地提供有效的治疗，也可减少疾病的传播。因此实验室必须正确掌握HIV感染的检测和诊断标准。HIV的检测试验有初步试验和补充试验两大类。其中初步试验包括HIV抗体的检测（HIV-1，HIV-2，HIV-1/HIV-2和HIV-1/HIV-2/O组），血液病毒学检测试验（p24抗原，HIV RNA和前病毒DNA）。如果标本在初步试验中是非反应的，则通常被认为是HIV阴性。如果有已知的高风险接触，通常建议进行随访，因为很多初步抗体试验可能不敏感。相反，如果初步试验是反应性，一般需进行重复检测，如果结果仍然是反应性，再进一步进行补充试验来完成HIV诊断。目前使用的补充试验包括免疫印迹（WB），间接免疫荧光检测（IFA），线性免疫试验（LineIA）和核酸检测（NATs）。

一、检测策略

HIV检测策略是为明确是否存在HIV感染而采取的一系列检测计划。一个或多个联合检测试验可提高检测的总体灵敏度或特异性。如果联合检测两个初步试验的任一一个为反应性即为阳性，这提高了单独试验的灵敏度。在这种情况下，结合灵敏度反映了任一试验所能达到的最好的灵敏度。如果策略需要两个试验都为阳性，则提高了特异性，而结合灵敏度却低于任一单独试验。尽管新一代试验的灵敏度和特异性都大大提高，但仅使用单一实验用于HIV诊断是很少见的。

以下出现的策略适用于病人的初步筛查或诊断，不适用于捐献者筛查，其对象包括24个月以上的病人标本。

在选择检测策略时实验室考虑因素：

1）检测目的，如诊断还是监测；

2）患病率、发病率和人群的其他特征，如亚型；

3）TAT要求（如职业接触后的紧急结果）；

4）样本类型，如血浆/血清、全血或唾液；

5）当地法规，如监管机构的要求或准则；

6）当地购买合同和政策；

7）试验有效率；

8）试验合适度；

9）检测量；

10）实验室大小；

11）可以使用自动化体系的大小和费用的先决条件；

12）实验室人员技术水平；

13）标本谱系知识，特别是先前的检测结果和病人的过去史；

14）病人追踪的机会，包括住院和相关的额外检测；

15）费用。

应明确检测策略潜在的局限性，包括：如果初步试验仅针对HIV-1，虽然存在交叉反应性，试验结果可能是反应性，但HIV-2和HIV-1 0组还是有可能漏检。HIV-1 NAT不能检测HIV-2。在血清转化期，某些补充试验可能为阴性。如果有必要应采取HIV-1 RNA或HIV-2 DNA确认初步试验，或者随访标本检测也可证明是血清转化。如果每个制造商的检测结果不可靠，应重新检测另一新标本。

一些策略中的步骤数和复杂性可增加TAT，使结果推迟。当地法规可能要求采用特定的试验或策略。

在策略流程图图中，A表示初步试验，可能是常规试验或者快速试验。B代表鉴别试验，用来区分HIV-1或HIV-2感染。C代表HIV-1NAT。D表示HIV-1抗体补充试验。策略中所有试验应遵循制造商说明书、实验室规章、适用的监管机构要求。

1 策略Ⅰ：单独的初步抗原/抗体联合免疫学试验

策略Ⅰ 使用灵敏的初步筛查试验，能在急性、早期和持续感染阶段检出HIV-1和HIV-2（最好的是抗原/抗体联合试验）。初步试验反应性标本应再用能区别HIV-1和HIV-2感染的抗体免疫学检测。如果鉴别试验也是反应性，表明HIV-1或HIV-2抗体存在。如果鉴别试验是阴性，应进一步采取定性或定量NAT来识别或排除急性HIV-1感染。根据急性感染的患病率，初步试验呈反应性标本<3%时，需要进行NAT。参考图1的策略Ⅰ。

注：1当不能进行抗原/抗体联合免疫学分析时，A可以是IgM灵敏的抗体免疫学试验；

  2 重复A（+）和B（+）根据试验而定；

  3 初步治疗和随访检测进行临床分期；

  4 HIV抗体阳性，进一步检测以排除双重感染；

  5 急性HIV-1感染；

  6 如果有临床症状，考虑进行HIV-2 DNA检测。

如果无法进行抗原/抗体联合试验,可以使用灵敏的IgM抗体免疫试验，如果怀疑是急性HIV感染，血清学阴性的结果应采用NAT进行检测（见策略Ⅵ，图6）。如果NAT示低拷贝数，可检测p24抗原确证急性HIV感染。很多定量NAT的假阳性结果常常<2000copies/ml，专家表示当结果<5000copies/ml时应怀疑为假阳性，并进行重复检测或随访证明血清转化。

如果怀疑是HIV-2感染，建议检测HIV-2 DNA。HIV-1和HIV-2抗体之间的交叉反应性较双重感染更为常见。当鉴别试验提示HIV-1和HIV-2共同存在时，建议稀释标本或者检测HIV-1RNA或HIV-2 DNA，明确HIV感染的型别。

如果根据策略Ⅰ确定病人为阳性时，建议在开始治疗后用定量病毒载量和CD4+T细胞测定进行临床分期。

2 策略Ⅱ：HIV-1/HIV-2抗体免疫学试验和HIV-1补充试验

连续的两个检测策略，其中初步试验应用常规免疫学试验或快速试验检测HIV抗体。如果初步试验为反应性，应进行更特异的补充试验，包括WB、IFA或更新的定性RNA检测，以确证存在感染。基于初步试验的血清转化灵敏度，此策略能识别大多数感染4-6周以上个体的抗体。参考图2的策略Ⅱ。

注：1 此步骤根据试验而定。

  2 如果怀疑是急性感染，参考规则Ⅵ。

  3 进一步采取WB或IFA确认HIV-1抗体是否存在。

  4 初步治疗和随访检测进行临床分期。

  5 考虑检测HIV-2抗体。

  6 一旦试验D检测为不确定性或阴性，建议立即进行NAT。

如果用唾液进行常规初步试验，策略Ⅱ是目前唯一的选择。

许多初步试验在感染早期较传统的补充试验（如WB、IFA）更灵敏，这增加了补充试验的不确定性或假阴性结果。这些初步试验除了能检测HIV-1，也可能检测到HIV-2和HIV-1 O组，即如果HIV-1/HIV-2初步试验是反应性而补充试验是不确定的或阴性的，说明标本对HIV-2抗体是反应的，这种情况应进行鉴别试验。而且，RNA试验作为补充试验时也不能检出所有的非B亚型、重组型或HIV-2。

根据策略Ⅱ确定病人为阳性时，建议在开始治疗后用定量病毒载量和CD4+T细胞测定进行临床分期。

3 策略Ⅲ：假定诊断的连续HIV抗体免疫试验

此策略连续地进行两个抗体试验，如果两者都是反应性（根据说明书按需进行重复），则可以假定结果是阳性的，可（不是必须）进行补充试验。此策略用于HIV-1或HIV-2的初步诊断，特别是有HIV感染临床症状的患者。参考图3的策略Ⅲ。

注：1 A2为不同于A1的免疫学试验，A2也可以是抗体鉴别试验，重复A1或A2反应性标本依试验而定。

  2 如果怀疑是急性感染，参考规则Ⅵ。

  3 例如定性或定量NAT或其他抗体补充试验可用于确证感染。

A1、A2应使用不同的抗原组分或基于不同的原理，尽可能减少非感染病人中的非特异性反应的可能。

此策略对高危人群或有明显临床症状的患者很有用处，且能在实验室和床旁应用。其TAT较短，得出假定结果后通知临床决定。但此策略没有最终的结论，其结果视为假定的，应对病人进行医学随访和额外检测，如定量病毒载量试验，以证实初步筛查试验的结果。

4 策略Ⅳ：初步唾液标本的连续HIV抗体免疫学试验

如果初步试验的标本为唾液，其结果为反应性，随后的血标本结果为阴性，则无需进行补充试验。如果唾液结果是反应性，而后面的血浆（采用不同的试验）结果是阴性的，但用初步试验检测血标本也是反应性，则结果为不确定性的，表明需要另外的试验。此策略适用于HIV-1和HIV-2的假定诊断，特别是用于POCT。参考图4的策略Ⅳ。

注：1 此规则仅适用于同一试验能对唾液和血标本同时进行检测的情况。反应性标本的重复检测依试验而定。

  2 如果使用仅针对HIV-1试验，则只得到HIV-1抗体阴性。

  3 如果怀疑是急性HIV感染，参考规则Ⅵ。

  4 标本可以是全血、血浆、血清。

  5 A2也可以是HIV-1/HIV-2抗体鉴别试验。

  6 例如可采用定性或定量NAT或其他补充试验确证感染

此策略能得到一个假定阳性的结果，可快速指导进行临床治疗和相关额外检测。A1唾液快速检测的特异性较血标本的检测低，所以此策略的设计是为了排除初步假阳性结果。如果结果不相符，可进行第三种试验以获得假定结果，增加预测的价值，但患者仍需要随访和额外试验。如果试验不能同时进行血标本和唾液标本的检测，应再使用第三种试验。

注意：A2可以是鉴别试验。

5 策略Ⅴ：初步HIV抗原/抗体鉴别试验

此策略用于初步HIV抗原/抗体联合检测HIV的抗原或抗体，同时也能区别抗原还是抗体。然后采用NAT或者p24中和，证实p24的反应性，提示急性HIV感染，而抗体反应性由HIV-1/HIV-2区别试验证实。此策略在筛查步骤中对HIV-1和HIV-2的初步诊断和确证很有用。参考图5的策略Ⅴ。

注：1 重复检测A（+）依试验而定。

  2 初步治疗及随访检测用于临床分期。

  3 HIV阳性，需进一步检测排除双重感染。

  4 急性HIV-1感染。需要第二份标本证明RNA结果或血清学转化。

  5 如有临床症状考虑HIV-2 DNA检测。

如果怀疑是急性HIV感染，应对血清学阴性标本进行核酸检测(见图6)。如果p24检测和随后的反应性标本中和作用代替NAT，则应注意在急性感染期，p24抗原比HIV RNA晚出现4-5天，且灵敏度可不如一些联合检测。抗体反应性标本可能仅用另一筛查试验A2检测，参考策略Ⅲ。

如果患者鉴定为阳性，建议在开始治疗后用定量病毒载量和CD4+T细胞测定进行临床分期。

6 策略Ⅵ：急性HIV感染检测

急性HIV感染策略比其他检测HIV抗体甚至p24的策略能更早的检测HIV感染。对HIV-1或HIV-1/HIV-2免疫试验为非反应性或无结论性的及其他怀疑是急性HIV感染的患者进行单个或汇集NAT以检测HIV RNA时，应遵循策略Ⅵ。参考策略Ⅵ。

注：1 汇集检测可能需要用户验证（用户决定汇集量选择性的重复检测）。

  2 急性感染，见报告部分。需要另一标本进行确认(如确认血清转化)。

  3初步治疗及随访检测用于临床分期。

如果怀疑是AHI，美国卫生署建议进行个体核酸检测及抗体试验。为减少检测费用，一些公共卫生实验室汇集HIV抗体阴性标本进行核酸检测，筛查急性感染。但由于稀释作用，汇集检测会减少低拷贝量标本的检出灵敏度。在AHI期，HIV-1/HIV-2联合检测能检出85%抗体阴性NAT阳性的标本。NAT检测RNA比抗原/抗体联合检测抗原早约4天，能用于确证抗体阴性而抗原/抗体联合检测是反应性急性感染（见图1）。对NAT阳性结果，如果制造商说明或者低水平的病毒RNA（<5000copies）时，应重复检测。定性和定量NAT都能检测RNA。检测需要较大的样本量，且大多需要血浆标本。

7 无结论或持续不确定定标本的解决方法

任何策略都可出现无结论的结果。抗体的交叉反应可能产生反应性或不确定的血清学检测结果，特别是当抗原来自于细胞培养的完整病毒裂解液。当补充试验结果不确定性时，NAT可排除HIV感染。大多数初步WB结果为不确定性的HIV-1感染患者在一个月里可检出HIV抗体。所以如果初步WB结果为不确定性，应在2-4周后对患者再次进行检测。如果一个月后WB结果仍为不确定性，则大多为非HIV感染，但需排除患者近期有HIV接触史。

二、HIV检测的质量控制

1 建立质量控制计划

质量控制计划是一套设计用来监控分析过程和检测有临床意义的误差的实验程序。在HIV诊断试验中，有很多与检测试剂盒或者试剂无关的因素可导至误差。误差在检测过程中的很多阶段都可出现，包括：标本采集、标本标记、标本分离/处理、转移、结果的读取/误解、错误转移至报告、报告的交流或解读等。这些误差很多可通过良好的实验规范来降低到最小。

（1）通过风险评估的方法学评价

评价使用一个新的HIV试验应包括新方法的风险评估，后者包括科学文献、试剂盒说明书的描述及通过负责完成此项试验的实验小组对实验过程的审核来考虑试验的优缺点。一个好的质量控制计划最先应考虑实验优缺点可能会如何影响实验结果的质量。正式的风险评估通常使用工具，如FMEA（失败模式与影响分析）。FMEA能识别检测过程中的每个步骤的风险并提出减少该风险的方法。FMEA表通过分析识别每一步骤中可能出现的失败点并对各个因素赋值，包括：

1）影响临床或实验室决定的严重程度；2）误差检出能力；3）出现的频率。这些因素得到的值相乘得出一个严重度比值。每个实验室应建立标准表明哪些严重度比值是可接受的风险，哪些需要减小。FMEA表还包括降低风险的措施及重新评估每个风险组的风险严重度。在此重评估中步骤中，质控品的使用有助于降低风险。

（2） 根据标准操作规程（sop）实施质量控制程序

风险评估后，应建立标准操作规程，评估试验的可靠性。质控计划应包括所有分析过程并描述这些过程如何提供可靠的实验结果。质控计划的sops用于日常操作和系统的周期性评价。质控计划的基本组成有：

质控品的类型。质控品的类型包括厂家提供和独立的质控品。另外，报告定量结果的试验需要不同水平的质控品，同时需要监测试验的线性范围。

分析质控品的频率。质控的频率必须以实验室对特定实验的风险评估为依据。影响风险的因素大体包括个人操作的变异、试剂换批号，设备的更新，储存或测试的环境温度的改变，整体测试的可靠性。

分析批的定义。分析批的定义取决于试验或者实验室处理标本的方式。一个分析批可能指自动分析仪上一次转移中的一个酶免疫分析板或者所有板。

质控品的位置。质控品的检测可在标本检测前，检测后，或者检测中的任何时候。根据可接受风险决定质控品的位置，sop应明确可靠质控位置与患者标本检测结果可靠性的关系。

检测可靠性的标准包括测定质控品性能范围的统计学分析，周期性数据审核的标准能检测趋势提示系统误差。质控的统计学评价包括建立平均值，标准差，变异系数，趋势，试剂盒和质控品改变后平均值的调整等已在其他文件上详细描述。

不可靠的检测、系统误差或漂移的解决方法。SOP应包括对质控不可靠的试验所得到的患者结果的处理的必要步骤作为质控计划的一部分。同样，根据数据的趋势检测到的系统误差的解决步骤也应纳入质控计划。

监控环境状况。

患者数据的趋势.查看患者人群的数据趋势以检测阳性率的突然变化，可揭示检测性能的问题。

根据仪器依赖的方法检测仪器的性能。

2 质控材料的类型

选择合适的质控品监测特定方法，监测应包括标本处理在内的整个试验过程。质控品应尽可能模拟患者标本，保证其监测试验过程的所有步骤。例如，含完整HIV病毒的血清质控品批准用于检测血清中HIV病毒或P24抗原的试验。合成衍生材料也可以作为质控品，但需进一步考虑他们是否能模拟检测靶标有意义的结构特性，后者可影响测定。例如，如果一个合成质控品来源于一个替代的病毒组装系统，在核酸提取中这个组装的靶标颗粒的表现是否同HIV病毒颗粒一样，或者目标序列的碱基组成和形成二级结构的能力是否相同，后者可能会影响核酸扩增试验的效力。

3 质控品的来源

（1）厂商提供的质控品

厂商提供的质控品是由试剂盒厂商提供并定值的。厂商提供的质控品有几种类型。试剂盒质控品作为检测试剂盒的一部分在每个分析批中同患者标本一样检测。内对照也是厂商提供的试剂盒的一部分，内对照和每个样本一起检测，监测每个标本的检测过程。例如PCR试验中，厂商提供的内对照与目标核酸无关，其作为试剂加入每个标本中，经历整个PCR过程，或者床旁设备中加入内对照试剂表明样本已加至设备中。另外，一些厂商也提供独立包装于试剂盒外的对照品。此类质控品的可接受标准由厂商决定。因此在试验中替换或者更改质控品需要进行可靠性验证，因为这些质控品是已建立的测试体系的重要组成部分。

（2） 独立质控品

独立质控品是非试剂盒厂商来源的，能从商业质控供应商购买或者由实验室自己制造（如剩余患者标本）。实验室自制的质控品在使用前必须充分验证其性能特征，证明其合格性。如果独立质控品由实验室自己制作，应有相应的SOP文件描述质控品的原材料，形成过程，检测其稳定性的过程和质控品的可接受标准。