肌钙蛋白完整版

检验医师

（一）肌钙蛋白复合物

肌钙蛋白复合物是一个异源蛋白，在骨骼肌及心肌肌肉收缩活动中起重要的调节作用。肌钙蛋白复合物由三种不同的亚基构成：肌钙蛋白T（TnT），肌钙蛋白I（TnI）和肌钙蛋白C（TnC）。每种亚基负责肌钙蛋白复合物的部分功能。TnT是原肌球蛋白结合亚基，调节肌钙蛋白复合物和细肌丝间的相互作用；TnI抑制肌动蛋白ATP酶的活性；TnC是钙离子结合亚基，对于钙离子依赖型的肌肉收缩起主要调节作用。

TnT和TnI在心肌中的亚型不同于其在骨骼肌中的亚型。人骨骼肌组织中存在两种亚型的TnI和两种亚型的TnT（skTnI和skTnT）。文献报道心肌组织中只有一种心肌特异性TnI（cTnI），然而TnT却有几种不同的心肌特异性亚型存在（cTnT）。TnC没有心肌特异性亚型存在，它在心肌组织中的存在亚型与其慢骨骼肌亚型相同。TnC的另一种亚型，快骨骼肌亚型，则更典型地存在于快骨骼肌中。

CTnI只在心肌中表达，从未发现在健康的或受损伤的骨骼肌中或者其他的组织中表达。cTnT的心肌特异性则可能有所欠缺，因为已有报道发现cTnT在有慢性骨骼肌损伤患者的骨骼肌中表达。

首先是cTnI其次是cTnT被用作心肌细胞死亡的标记物。现在这两种蛋白都已经被广泛应用于急性心肌梗死（AMI）, 不稳定心绞痛，手术后心肌损伤，以及其他与心肌肌肉损伤有关的疾病的诊断。

这两种标记物都可在胸痛发作后3到6小时内在患者血液中被检测到，并在16到30个小时之内达到峰值。血液样品中cTnI和cTnT浓度的升高甚至可以持续到症状出现后的5到8天，说明这两种蛋白对于急性心肌梗死的后期诊断同样有价值。

1. 肌钙蛋白I

1.1 人心肌肌钙蛋白I

人心肌肌钙蛋白I在心肌组织中只有一种亚型，分子量为23876 Da, 由209个氨基酸组成，理论等电点为9.87。cTnI分子的第22位和第23位是丝氨酸。这两个氨基酸都可以在体内被蛋白激酶A磷酸化。这意味着4种形式的cTnI共存于细胞中，分别是一种未磷酸化、两种单磷酸化和一种双磷酸化结构。磷酸化改变cTnI的构型并改变cTnI与其他肌钙蛋白亚基的相互作用，以及与抗TnI抗体的相互作用。最新研究发现，释放到患者血液中的cTnI有相当数量是被磷酸化的。

超过二十年以来，cTnI已经被认为是心肌组织损伤的可靠标记物。cTnI在心肌梗死诊断上被认为比过去数十年的“金标记”——CK-MB和其它常用标记物如肌红蛋白、乳酸脱氢酶同工酶更灵敏，特异性更高。

HyTest 的cTnI是从人心肌组织中通过免疫亲和法以及进一步的离子交换层析法提纯。产品中含有一定量（<5％）的保留了肌钙蛋白免疫活性的降解片断。根据免疫研究和质谱研究，cTnI被乙酰化（从分子的N端）和部分单磷酸化以及双磷酸化。从心肌组织中被分离的cTnI包含了翻译后的各种修饰，代表着比高度提纯的重组cTnI更天然的蛋白形式。

在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)上，cTnI表现为一条单一条带，表观分子量为29kDa（图1，泳道3）。

完全磷酸化（被蛋白激酶A双磷酸化）和部分磷酸化（被碱性磷酸酶去磷酸化）的cTnI可以应客户要求制备。

1.2 人心肌肌钙蛋白复合物（I-T-C）

在心肌肌钙蛋白复合物中，最强的分子间作用已被证实为cTnI-TnC二元复合物间的作用，尤其是当钙离子存在时（Ka = 1.5x10-8 M -1）。这个作用对于cTnI的免疫检测非常重要，应在检测试剂制造商的考虑之中。TnC与cTnI形成复合物，改变了cTnI分子的构型，屏蔽了cTnI部分表面，因而影响了某些抗cTnI抗体和此抗原的反应。所以，cTnI在肌钙蛋白复合物中的免疫属性与其游离状态时的免疫属性有很大的不同。某些能识别游离态cTnI的单克隆抗体不与cTnI-TnC二元复合物或cTnI-cTnT-TnC三元复合物中的cTnI反应，反之亦然。根据最新数据，cTnI是以与TnC形成的二元复合物或与cTnT和TnC形成的三元复合物形式释放到患者血液中。

cTnI-TnC复合物的形成对于提高cTnI分子的稳定性起着非常重要和积极的作用。cTnI的游离形式非常不稳定，而其在cTnI-TnC以及cTnI-cTnT-TnC复合物中的稳定性则被证实有显著的提高。因此，这两种形式的复合物更适合被用于制备标准品和校准品。

在HyTest提供的肌钙蛋白复合物中，cTnI的存在形式与其在急性心肌梗死患者血液中被检测到的形式相同。肌钙蛋白复合物的纯化在温和的条件下进行，不使用含有尿素的缓冲液处理（通常纯化肌钙蛋白亚基的条件）。复合物中三种成分的浓度都被精确测定（表1）。

实验证明cTnI在其天然复合物中的稳定性远远高于其纯化的单体或用纯化的各肌钙蛋白亚基人工合成的复合物 (图2)。

肌钙蛋白复合物的SDS-PAGE结果显示主要有三条带——cTnT, cTnI和TnC。相应的表观分子量分别是39、29、18 kDa （图1，泳道1和5）天然肌钙蛋白复合物较于纯化cTnI或人工合成复合物的优点包括：

- 抗原与其在急性心肌梗死患者血液中的形式相同

- 三级结构保持不变

- 抗体结合位点不变

- 适合用于制备标准品和校准品

- cTnI的高度稳定性

HyTest 的肌钙蛋白I-T-C复合物已经被美国临床化学协会cTnI标准化委员会（AACC cTnI Standardization Subcommittee）选为国际参考物。标准参考物(SRM&#174;2921)由美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology）提供。详细信息请见www.nist.gov。

HyTest拥有“肌钙蛋白I诊断方法及试剂盒”的专利（US7285418和EP0938678）。

1.3 人工I-T-C和I-C复合物

由高度纯化蛋白合成的人工三元（I-T-C）和二元（IC）复合物可以应客户要求制备。

1.4 肌钙蛋白I多形式试剂盒

多种心肌肌钙蛋白I（cTnI）的形式可在人血液中被检测到。这些翻译后修饰的形式诸如磷酸化，蛋白酶水解，以及与肌钙蛋白C（TnC）形成复合物等都在cTnI分子的文献中有所描述。用于检测cTnI的抗体应该能以同样的效率识别血液中不同形式的cTnI。

HyTest的cTnI多形式试剂盒包括4 对抗原（正常／修饰后），用于测试检测系统对不同的cTnI修饰后形式（包括复合物的形成，磷酸化，蛋白水解，及样品中肝素的存在）的敏感度。试剂盒包括：

1. 游离和复合（人工）形式的cTnI

2. 人工部分磷酸化和去磷酸化的肌钙蛋白复合物

3. 不完全蛋白酶降解前和降解后的天然肌钙蛋白复合物

4. 不含有肝素的cTnI和结合有肝素的cTnI

1.5 肌钙蛋白I校准品

cTnI校准品由分离的天然肌钙蛋白复合物重组于正常人血清中。校准品涵盖浓度从0到100ng/ml。

其他不同浓度的cTnI校准品可应客户要求制备。

1.6 无心肌肌钙蛋白I血清

无cTnI血清由正常人混合血清通过免疫亲和层析提纯而来。亲和吸附剂附有几种有不同识别位点的单克隆抗体，不仅去除了血清中完整的cTnI分子，并可去除它的蛋白质水解片段。通过ELISA检测，无cTnI血清中cTnI水平不高于0.03 ng/ml。无cTnI血清可用作制备标准品和校准品的基质。

1.7 人骨骼肌肌钙蛋白I（skTnI）

用于人心肌TnI检测的抗体不应与肌钙蛋白的骨骼肌形式有交叉反应。如果有交叉反应，在检测急性或慢性心肌损伤患者血液时，假阳性结果就可能出现。基于这一点，用于检测心肌TnI的抗体应对样品中骨骼肌TnI不敏感。HyTest的skTnI是从人骨骼肌组织中通过免疫亲和法和进一步的离子交换层析纯化而来。SDS-PAGE显示有两条带，TnI的快骨骼肌亚型和慢骨骼肌亚型。

肌钙蛋白I 的骨骼肌亚型被建议作为急性或慢性骨骼肌损伤的标记物。在人骨骼肌中，肌钙蛋白I有两种亚型，慢骨骼肌肌钙蛋白（186个氨基酸，分子量21561，理论等电点9.61）和快骨骼肌肌钙蛋白（181个氨基酸，分子量21207，理论等电点8.88）。

2. 肌钙蛋白T

2.1 人心肌肌钙蛋白T（cTnT）

类似于cTnI，TnT的心肌亚型被广泛用作心肌细胞死亡的标记物。作为标记物，cTnT具有与cTnI相同的释放到患者血液中的动力学以及对于微小心肌损伤诊断的灵敏度，但是它的心肌特异性则不如cTnI。

cTnT从人心肌组织中通过免疫亲和法和进一步的离子交换层析纯化。在SDS-PAGE上表现为一条单一的条带，表观分子量为39 kDa（图1，泳道4）。

2.2 人骨骼肌肌钙蛋白T（skTnT）

TnT有两种亚型在人骨骼肌中表达。一种典型地存在于慢型骨骼肌中（277个氨基酸，分子量32817，理论等电点5.86），另一种存在于快型骨骼肌中（257个氨基酸，分子量30465，理论等电点6. 07）。分离出的人骨骼肌肌钙蛋白T包含这两种亚型，在SDS-PAGE上表现为两条带。

2. 肌钙蛋白C

肌钙蛋白C（TnC）有两种亚型在人骨骼肌中表达。一种典型地存在于慢型骨骼肌中，另一种典型地存在于快型骨骼肌中。在心肌中，TnC以慢骨骼肌亚型存在，包含161个氨基酸，分子量18416，理论等电点为4.05。

TnC与cTnI形成高亲和力的复合物。cTnI已被证实主要以和TnC形成的复合物形式存在于急性心肌梗死患者的血液中。在二元cTnI-TnC复合物中TnC保护cTnI不受蛋白酶切割。因此，TnC可被用作cTnI在水溶液中的天然稳定剂。

TnC从人心肌组织中通过免疫亲和法以及进一步的离子交换层析纯化。TnC在SDS-PAGE上表现为一条单一的条带，表观分子量为18 kDa（图1，泳道2）。

（二）高灵敏度cTnI检测系统的概念

2007年，科学界与医学界庆祝了第一个肌钙蛋白I检测方法科学论文发表20周年（Cummins B,Auckland ML, Cummins P. Cardiac-specific troponin-I radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction.Am Heart J. 1987 113(6):1333-44.）。可以肯定在过去的二十年中，肌钙蛋白I的检测方法有了巨大的进展。目前检测系统的灵敏度比1987年Cummins博士所描述的实验方法的灵敏度大约高出1000倍（10 pg/ml对比10ng/ml）。使用多株新单克隆抗体分别识别cTnI不同抗原决定簇便能够检测到血液中cTnI的所有类型（单体和复合物，磷酸化，部分降解等类型）。用特定抗原作标准品或校准品使不同厂家检测系统的相关性提高了超过10倍。所有这些改进使得肌钙蛋白I检测成为临床实践中更加精确和可靠的工具。

新一代高灵敏度cTnI检测系统提高了小面积心肌组织坏死或凋亡的检出率。然而，一些临床样品仍存在问题。某些患者血液中cTnI特异性自身抗体的存在（Eriksson S, Hellman J, Pettersson K. Autoantibodiesagainst cardiac troponins. N Engl J Med.2005 6;352(1):98-100.）使得对于抗原的检测非常困难。自身抗体与检测抗体竞争抗原表面结合位点，使肌钙蛋白I在诊断检测中“隐形”。自身抗体对于小面积损伤的影响更加突出，因为在这种情况下人体血液中抗原浓度会很低。通过测试多个血液样品，我们的专家已找出被自身抗体识别的主要抗原决定簇。这些发现使我们能够选择完全或者几乎不受样品中自身抗体影响的单克隆抗体去开发cTnI检测系统。

因此，越来越明显，我们必须谨记，高灵敏度的肌钙蛋白I检测系统应该使用不受各种修饰影响的抗原决定簇特异性抗体，因为人血液中的抗原可能带有这些修饰。这个测试概念在以下介绍中有详述。

肌钙蛋白I的心肌亚型（cTnI）是现代心肌细胞损伤和死亡的黄金标准。不同的诊断平台定量检测人血液中cTnI，已被广泛应用于大型医院和小型化验室。然而，不同的检测方法之间仍缺乏一致性。我们常常发现一个相同的血液样品用不同的cTnI检测方法检测时会得出不同的数字。

检测方法差异的最常见原因是不同方法所用抗体的抗原决定簇特异性不同。我们现在知道不同的因素会影响cTnI的检测值，包括翻译后修饰（蛋白水解降解，磷酸化，与其他分子（肌钙蛋白C，肝素）形成复合物以及患者血液中循环的cTnI特异性自身抗体。各种方法中使用的不同的单、多克隆抗体会受这些因素不同程度的影响。

HyTest的专家致力于cTnI的研究已经超过了20年。我们已经生产并测试了对cTnI分子的不同部位具有特异性的几千种单克隆抗体；我们尝试了几百种不同的双部位单克隆抗体组合以便于找到最适合cTnI精确免疫分析的抗体。根据我们的研究结果，我们可以确定，目前不可能找到一对抗体（一个捕获抗体和一个检测抗体）完全不受所有已知的cTnI修饰和干扰的影响。我们认为，可用于cTnI精确免疫检测系统开发的单抗组合，应该使用2种单克隆抗体作为捕获抗体（板包被或颗粒包被），2种单克隆抗体作为检测抗体（与特殊的标记物结合）。我们称这种方法为2+2概念。在这种检测系统中，单克隆抗体的选择方式应该是如果一种单抗（捕获抗体或检测抗体）受样品中某种因素的影响，另外一种单抗应该不受相同因素的影响。负面或正面干扰从而被最大程度的减少。除此之外，一个很重要的因素应该被考虑到：检测中使用的抗体应该只对cTnI的心肌亚型有特异性，不应与两种骨骼肌亚型有交叉反应。

目前，根据2+2概念，HyTest可以推荐几种有助于cTnI检测系统开发的单克隆抗体的组合。这些检测系统只具有心肌特异性，几乎不受所有已知的干扰cTnI检测的因素影响。而且，在选择单克隆抗体时，我们还考虑到了新一代的cTnI检测系统应具有高灵敏度，抗体的组合可以被应用于即时诊断平台。因此，表3中描述的组合具有良好的反应动力学，和对抗原的标准品（肌钙蛋白I复合物）的高度敏感性。

图4为影响cTnI检测因素示意图。对分子不同部位具特异性的抗体受这些因素不同程度的影响。例如，众所周知，纯化cTnI极易被蛋白酶降解。但是，在肌钙蛋白复合物中，cTnI的中心区域与肌钙蛋白C（TnC）紧密作用，TnC保护cTnI不被蛋白酶降解。因此，位于cTnI分子中心区域的抗原决定簇远比位于分子两端的抗原决定簇更加稳定。同时，TnC和抗体竞争与cTnI结合。只有少数对cTnI中心区域有特异性的抗体，可以识别抗原的复合物形式。

在图5到9中，我们比较了根据2+2概念设计的新的检测系统与传统的受不同因素影响的检测系统，从而阐明了新的检测系统不受这些因素的影响。

A 心肌特异性

人体中有三种形式的cTnI：一种在心肌中表达（心肌TnI），另外两种是慢型骨骼肌和快型骨骼肌的基本要素（分别是慢型skTnI和快型skTnI）。cTnI和慢型skTnI的序列大约40％一致性，尽管cTnI和快型skTnI的相似性要小一些，但仍不可忽视。因此，用于cTnI检测的所有抗体都应该确保不与其骨骼肌亚型有交叉反应。从图5中可以看出，即使检测高浓度的skTnI（50 ng/ml），新检测系统也不产生信号，从而显示了它们极高的心肌特异性。

B 对肝素的敏感度

cTnI是一个高碱性的分子，理论等电点为大约9.9，很容易与带负电的分子形成复合物。肝素在临床实践上被广泛用作抗凝剂，几乎所有被怀疑急性心肌梗死的患者在入院的第一时间都会被注射肝素。已证实某些抗cTnI单抗对样品中的肝素很敏感，对含有肝素的样品给出较低的信号（图6，228-MF4组合中的单抗228）。2+2概念中使用的单抗对肝素作用不敏感。

C 对磷酸化（蛋白激酶A）的敏感度

第22位和第23位的两个丝氨酸可以在体内被蛋白激酶A磷酸化，所以4种形式的蛋白（一种未磷酸化，两种单磷酸化和一种双磷酸化结构）可以共存于细胞中。cTnI的磷酸化改变了蛋白的构型并且改变了它与其他肌钙蛋白的相互作用，以及与某些抗cTnI抗体的相互作用（图7，19C7-1G11和19C7-22B11组合中的单抗1G11和22B11）。根据最新发现，释放到患者血液中的cTnI有相当大的一部分被磷酸化。2+2概念中使用的单抗对cTnI磷酸化状态不敏感。

D 对蛋白水解酶降解的敏感度

cTnI是一个已知的极度不稳定的分子。我们将天然肌钙蛋白复合物和内源组织蛋白酶一起反应116个小时，再用2+2检测系统检测。在所有的2+2分析中，抗原显示了比使用识别分子末端的对比抗体9F6和p45-10检测系统（此检测系统对抗原的降解敏感）大幅提高的稳定性。

E 对自身抗体存在的敏感度

近期研究显示某些血液样品（总人数的5-10％）含有大量的cTnI特异性自身抗体。这些样品中的抗原浓度可被很大程度地低估或者抗原变得不可测（样品中浓度很低的情况下）。2+2概念中，我们使用至少一个受自身抗体存在影响小的捕获单抗和检测单抗。因此，新的检测系统甚至能够在自身抗体含量高的样品中检测到抗原。

目前HyTest拥有对cTnI分子的所有部位特异的抗体。所有单抗的特异性识别位点都已经被SPOT技术或其他使用不同多肽库的方法精确确定。这些抗体可以被用于科学研究以及新一代cTnI检测系统的开发。

HyTest的科学家们将所有的cTnI特异性单抗都分别作为捕获抗体和检测抗体在夹心荧光免疫检测系统进行测定，得到了如下的抗体组合：

表中的抗体组合显示了高灵敏度（图10），良好的反应动力学，低背景，以及高重复性。使用单抗组合（识别不同的抗原决定簇的2到3个抗体）作为捕获抗体，以及2到3个单抗作为检测抗体，夹心免疫检测系统的灵敏度可以提高2到4倍。使用推荐抗体的免疫检测系统在识别抗原的单体或复合物形式时灵敏度不变。最新证实在急性心肌梗死后坏死的肌肉中，cTnI被内源蛋白酶裂解。因此，在胸痛发作后几小时，完整的cTnI分子及其降解片段的混合物可在血液中被检测到。cTnI分子的不同部位显示不同的稳定性，最稳定的区域位于第30位和第110位氨基酸之间，可能基于TnC对它的保护。欲提高检测系统的灵敏度和可重复性，我们推荐使用识别分子稳定区域的抗体或者对分子不同部位具有特异性的抗体的组合（多于一个单抗作为捕获抗体和检测抗体）。即使使用单抗的组合作为捕获抗体和检测抗体，至少其中也要有一个抗体对分子的稳定区域具有特异性。

在检测系统设计中，应该考虑到检测系统不应受cTnI分子的部分降解，氧化还原，磷酸化，与TnC形成复合物，样品中肝素的存在以及负面干扰影响。我们推荐的抗体组合不受这些因素的影响。这些抗体都已被传统的夹心免疫检测系统以及免疫层析法验证。

（三）对人心肌肌钙蛋白复合物的检测

在急性心肌梗死患者血液中，大部分的cTnI以二元I-C复合物或三元复合物的形式存在。游离cTnI亚基的浓度远远低于复合物形式cTnI的浓度。因此，HyTest新的抗人心肌肌钙蛋白复合物单抗20C6和Tcom8能够与人cTnI特异性单抗（目录号4T21）或TnC特异性单抗（目录号4T27）配对被应用于cTnI夹心免疫分析，见表6和图18 。这种检测系统显示了针对纯化和内源性抗原很高的灵敏度（0.01 ng/ml，图19）,良好的反应动力学，低背景，高重复性以及对于样品中抗cTnI自身抗体存在的相当低的敏感性（图20）。图19对比了新方法（Tcom8-7B9）与两种传统方法（19C7-560和2+2检测系统）的校准曲线。

新检测系统对于自身抗体的负干扰敏感度降低。当天然肌钙蛋白复合物被加入到含有大量抗cTnI自身抗体的捐献者血液样品中时，新检测系统的灵敏度比全部使用cTnI分子特异性单抗的上一代cTnI检测系统有显著的增高（图20）。

除了一个例外——样品中有EDTA的存在，不同的添加物和抗原的修饰没有明显影响这种新方法的抗原识别能力（图21）。众所周知EDTA通过改变TnC分子的构型以改变（减少）肌钙蛋白复合物中TnC和TnI亚基的亲和力。这有可能导至单抗Tcom8和抗原亲和力的降低。因此，这个结果显示了新方法不适合用于检测含有EDTA的样品。

初步的临床试验显示在出现轻度心肌状况的患者血液中，新的检测系统能够比最好的传统方法检测到更多的cTnI（图22）。这使得新方法更适用于急性心肌梗死的早期诊断或与小面积心肌坏死有关的轻度心肌状况的诊断。

来源：hytest