ELISA检测技术

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ELISA检测技术

ELISA在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定，在国内有人译作酶联免疫吸附试验，它是一种免疫测定，是把抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种非放射性标记免疫检测技术。近年来，随着单克隆抗体技术和酶标记技术的发展与应用，市场上已出现了各种各样的商品化ELISA试剂盒，广泛应用于临床医学、动植物食品检验、生物学研究等领域。本文主要是对ELISA 技术的基本原理、类型、影响因素加以综述。

1 ELISA基本原理

ELISA是以免疫学反应为基础，通过抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

2 ELISA 基本类型

ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据试剂的来源和标本的性状以及检测所具备的条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要有直接ELISA间接ELISA夹心ELISA，以及在此基础上设计出的竞争和抑制ELISA。

2.1 直接ELISA

直接法被认为是最简单的ELISA 反应形式，其原理是包被抗原或抗体，直接加入酶标记的抗原或抗体进行反应，可用于目的抗原或抗体的直接检测。

2.2 间接ELISA

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断，间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

2.3 夹心ELISA 夹心法 可被分为直接夹心ELISA 和间接夹心ELISA 两种反应体系。

（1）直接夹心ELISA 该方法是将抗原或抗体吸附在固相载体上，加入待测标本与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体或抗原及底物溶液进行测定。

双抗体直接夹心ELISA 是检测抗原最常用的方法，这种方法的缺点是:①双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。②必须准备标记好的抗体，根据不同的抗原，须制备不同的酶标抗体。优点:①抗原两侧的抗体可以是相同来源的抗体。②待检病料中的抗原不需要纯化，这在间接法中是不允许的。

双抗原夹心法测抗体，反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物， 以检测相应的抗体。 本法关键在于酶标抗原的制备，抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

（2）间接夹心ELISA 其原理和双抗体直接夹心ELISA 相比较，酶没有标记在抗体上，而是标记在抗抗体上。这种方法的缺点是：抗原两侧的抗体必须是来源不同种属动物的抗体。优点：除具备上述双抗体直接夹心ELISA优点外，它还具备间接ELISA 的优点。

2.4 竞争和抑制ELISA

竞争和抑制ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 以上的三种方法都可以设计成竞争和抑制ELISA。 以测定抗原为例，直接竞争ELISA 检测抗原，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。

除以上几种形式外，目前常把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，以提高ELISA 的敏感度。亲和素和生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大，此外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。

3 影响ELISA 反应的关键因素

ELISA 类型众多，实验人员需要根据已有的实验材料来设计最合理的反应形式。尽管ELISA 反应过程简单，但存在很多影响因素。 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。

3.1 对实验人员的要求

进行ELISA 操作的人员应经过培训，掌握大量相关知识和基本技能，如检验项目的基本原理（ELISA 原理）；临床意义；熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识等。

3.2 对实验试剂的要求

（1）血清是ELISA 检测的常用标本， 可按常规方法采集，应注意避免溶血，因为红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

（2）ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。 自配的缓冲液如PH9.6的碳酸盐缓冲液或PH9.7的磷酸盐缓冲液等使用前应用PH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。

3.3对实验器材的要求

（1）移液器 由于ELISA 样品用量少，多以微升计量，其准确性直接影响试验果， 因此应请技术监督部门进行年度校正或自行校正。

（2）恒温箱 37℃是ELISA 反应最常用的温育温度，要经常检查恒温箱温度计所示的温度实测温度是否一致，温度控制以恒温箱温度为准，以保证温育条件的一致性。

（3） 酶标仪 经常维护其光学部分，如用无水乙醇擦拭，防止滤光片霉变，定期检测校正（有的仪器配有自校程序）。

3.4对实验操作的要求

（1）加样 加样前应先检查移液器的准确程度，有问题及时校正，保证每孔中液体量相同。加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。每次加标本应更换吸嘴，避免发生交叉污染。

（2）温育 为促进抗原抗体反应，温育时无论采用水浴还是在保温箱的湿盒中反应，都应使水浸没ELISA 板边缘的1/3。同时，为避免蒸发，板上应加盖，也可用保鲜膜覆盖板孔。

（3） 洗涤 受实验条件所限，目前大多数实验室或检测机构均采用手工洗涤的方式。洗涤是ELISA反应最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视。 洗板时要一次用力将液体甩出，应尽量避免液体四处迸溅，然后在清洁毛巾或吸水纸上拍干。

（4）显色 不同的酶标抗体对应的底物也有所不同，但大多数情况下使用的是OPD和TMB。若用OPD做底物进行显色，应注意避光操作，防止其分解，影响结果的准确度。因此，建议在暗盒中显色。

（5）读数 ELISA反应的结果很明显，用肉眼即可做出判断，但对于弱阳性的反应孔容易发生误判。建议使用酶标仪进行结果的判定。 在用酶联仪读数前应先将仪器预热15-30min，并用吸水纸拭干板底附着的液体，将反应板平稳地放入酶联仪的比色架后测定特定波长下的OD值。

（6）反应条件优化后，应确保每步反应的时间!温度及其他反应条件的稳定，以保证反应体系的稳定性。