肿瘤标志物的临床应用、问题及思考

检验医师

李金明，研究员，医学博士。卫生部临床检验中心副主任。中国医学科学院北京协和医学院和北京大学医学部博士生导师，享受国务院政府特殊津贴，卫生部有突出贡献中青年专家。在国内系统地提出了临床分子诊断实验室管理、检测质量保证及标准化的概念和方法。研究方向：临床分子诊断方法及标准化和基因治疗载体。以项目负责人承担国自然课题5项，863课题1项。在以第一和通讯作者发表论文150多篇（SCI 42篇）。国家863计划生物和医药技术领域体外诊断技术产品开发重大项目总体专家组成员以及国际临床化学协会分子诊断委员会等10多个学术团体委员。中南大学和厦门大学兼职教授。中华检验医学杂志和临床检验杂志等李金明多个杂志编委。

        肿瘤标志物（Tumor marker，TM）是指存在于血液、体液和组织中可检测到的与肿瘤的发生、发展有关的物质，其或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织中的含量，其存在或量变可提示肿瘤的性质，从而了解肿瘤的发生、细胞分化及功能，在肿瘤的诊断、分类、预后和复发判断及指导临床治疗中起辅助作用。TM通常包括蛋白质（上皮粘蛋白、胚胎蛋白、糖蛋白等）、激素、酶、糖决定簇、病毒和肿瘤相关基因及其结构改变等。最早的肿瘤标志物可以追溯到1846年在多发性骨髓瘤患者尿中发现的一种特殊蛋白，后以发现者的名字命名为本-周（Bence-Jones）蛋白，用于多发性骨髓的辅助诊断。1928年后，众多的激素类、蛋白类肿瘤标志物相继被发现，并用于临床检测，如人绒毛膜促性腺激素（hCG）；促肾上腺皮质激素（ACTH）；甲胎蛋白（AFP）；癌胚抗原（CEA）；糖蛋白（CA125）和鳞状细胞癌相关抗原（SCC）等；糖决定簇包括CA19-9、CA50和CA72-4等；酶类包括前列腺特异抗原（PSA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、前列腺碱性磷酸酶（PAP）和前列腺酸性磷酸酶（PACP）等；上皮粘蛋白如CA15-3、CA549和BR27.29等；病毒如人乳头瘤病毒（HPV）、EB病毒和乙型肝炎病毒（HBV）等；基因如BRCA1/BRCA2遗传性乳腺癌相关基因、APC基因（家族性腺瘤样息肉病筛查）和微卫星不稳定性（MSI，用于遗传性非息肉性结肠癌筛查）；基因结构变化如kRAS和上皮生长因子受体（EGFR）基因突变与结直肠癌和非小细胞肺癌靶向治疗药物使用；外周血游离DNA的量等。此外，新的肿瘤标志仍在不断发现。如此众多的肿瘤标志物，再加上肿瘤标志物通常在正常和良性疾病情况下也有不同程度表达，表现在体液中有量的变化，因此，肿瘤标志物对特定的肿瘤通常缺乏特异性。临床实践中，如何正确而又有效地使用肿瘤标志物，在国际上，一些学会或组织制定了一些指南，如美国国家临床生化学会（NACB）、美国癌症学会（ACS）、美国内科医师协会（ACP）、美国临床肿瘤学会（ASCO）和欧洲肿瘤标志物专家组（EGTM）等。但由于长期以来所形成的观念和人们对肿瘤的恐惧心理，肿瘤标志物的临床应用仍存在诸多的问题。

        一、肿瘤标志物用于肿瘤诊断的问题

        如上所述，肿瘤标志物器官和组织特异性通常较差，诊断特异性能达到80%以上，就已经是特异性很好的标志物，但由于肿瘤在人群中的流行率很低，因而肿瘤标志物如采用定性的方法进行检测，其阳性预示值很低，也就是说，单以肿瘤标志物检测阴、阳性来判断一个患者是否存在肿瘤，其假阳性率将很高。因此，肿瘤标志物一般不适用于正常人群的体检，否则对于出现假阳性的被检者，可能会出现较大的精神压力，笔者曾从一家肿瘤医院科室主任听说一个这样的例子，即某人因年度体检，查了包括CEA在内的几项肿瘤标志物，结果CEA较正常值高，于是该人进行几乎全身的影像和窥镜检查，尽管什么也没发现，但该人从此再无心思工作，频繁找这位医生询问有否新的方法来确定其是否患上了肿瘤。可见，将缺乏特异性的肿瘤标志物用于肿瘤筛查，对于心理承受能力较差的人，一旦出现阳性结果，可能会出现意想不到的严重后果。但肿瘤标志物是不是就一定不能用于筛查呢？这要具体情况具体分析，有些肿瘤标志物AFP、PSA、CEA、hCG等，对于高危人群，如有特定肿瘤家族史、有症状、有特定疾病如慢性肝炎病毒感染者和肝硬化等者，以及年龄较大者，可以体检加入这些特定肿瘤标志物的检测，但应就相应阳性检测结果，向患者做出恰当的解释及进一步检查观察的建议，避免应解释不当而出现患者焦虑不安的情况。

        美国国家临床生化学会（NACB）最新的指南指出，将以前认为最具器官特异的PSA建议不作为前列腺癌筛查标志，但可作为疾病复发和治疗监测标志。游离PSA测定在总PSA<10μg/L时，可作为区分良性和恶性前列腺疾病的标志。

        二、肿瘤标志物用于肿瘤早期诊断的问题

        关于肿瘤的早期诊断乃至预测，一直是肿瘤标志物研究者们的梦想，也是多年来很多课题研究的目标[5]，也有不少研究论文发表，截止到2013年4月，在PubMed上同时输入Tumor marker和early diagnostics，会搜索到303个Items，比2009年5月的162个多了将近一倍。但至今为止，人们仍然没有找到可以明确进行肿瘤早期诊断的标志物，实际上，这也是一个在目前不太可能实现的梦想。这里有一个概念，即什么时候算是“早期”？是以肿瘤大小来衡量，还是以肿瘤细胞的出现来说明。如果是以前者为准，显然生物学标志物作为肿瘤早期诊断标志物是不适用的。如果以后者为标志，一则我们还无法去找到一个肿瘤细胞的出现，二则机体内肿瘤或前肿瘤细胞可能随时会出现，只不过机体的免疫监视功能将其很快的清除。应该说，真正的可用于肿瘤早期诊断的特异生物学标志物，在目前及以后相当长的一段时间内，还难以找到。即使有生物学标志物，肿瘤的早期发现还得依赖于影像诊断，因为即使生物学标志物异常，如果影像结果什么也找不到，医生只能是“望洋兴叹”，不知道何处寻找那一根“针”。因此，美国国家临床生化学会（NACB）最新的指南指出, CA125与阴道超声一起可作为高危女性卵巢癌早期诊断指标。

        自人类基因组计划实施并完成人类基因组测序后，检测一些抑癌基因突变或甲基化等，以预测肿瘤的发生，基本上属于概念炒作的范畴，无实际应用价值，因为从发表的科学文献上看，这些突变或甲基化只是在肿瘤患者出现频率较正常人高，在统计学上有显著性差异，但就某个特定的个体来说，其并不具备肿瘤发生的预示意义。此外，一个临床检验项目，应用于临床疾病的诊断治疗或疾病预测，其前提是，人们应该有预防、阻断、治疗的方法，否则这种检测不但没有任何价值，反而会给被检者带来巨大的心理和社会压力。当然，也有人说，可以给被检者建议一种良好的生活方式，如不吸烟、少喝或不喝酒、避免接触有害物质等，这种建议其实与任何检验结果无关，因其对所有人都是适用的，不需以某种检验结果为前提。

        三、肿瘤标志物联合检测的问题

        肿瘤标志物因为缺乏器官特异性，用于肿瘤的临床诊断在特异性上通常都不高，同一肿瘤可出现多个肿瘤标志物，不同肿瘤亦可同时出现同一肿瘤标志物，因此，对某一特定肿瘤来说，检测一种肿瘤标志物，通常检测的临床诊断敏感性不高。为提高肿瘤标志物的临床诊断敏感性，不断有人尝试将多种肿瘤标志物进行组合检测[4]。其实，这是一个误区，因为如果单个肿瘤标志物不具备特异和灵敏诊断肿瘤的价值，则也不可能出现理想的对某一肿瘤特异灵敏的联合应用模式。肿瘤标志物因为其特异性不高，基本上只能用于肿瘤的疗效观察以及治疗和复发监测，联合检测不应是出于肿瘤诊断的目的，而是在肿瘤患者治疗前，筛选能灵敏地指示疗效以及治疗和复发的标志的方法。但有些肿瘤标志物的联合检测对特定肿瘤有意义，如AFP、HCG和乳酸脱氢酶可作为睾丸癌诊断/病例发现、疾病分期、预后、复发和治疗监测。AFP也可用于区分非精原和精原细胞肿瘤。

        四、肿瘤标志物检测的标准化问题

        肿瘤标志物多为结构较复杂的蛋白或只能通过抗体确定的糖抗原表位，不同试剂生产厂家由于使用的抗体不同，其对同一份标本测定的同一肿瘤标志物的浓度可能会有所差异，因此，为保证不同实验室间肿瘤标志物检测结果的一致性，肿瘤标志物检测的标准化极为必要。进行标准化的先决条件是，标准品和检测物应该是相同的，否则标准化就无从谈起。

        涉及到肿瘤标志物测定标准化的组织有世界卫生组织（WHO）生物学标准化专家委员会（The Expert Committee on Biological Standardisation，ECBS），其负责建立生物物质的国际标准及参比材料。WHO通过国家生物学标准和质控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）提供大多数多肽激素和一些肿瘤标志物的国际标准品。一些区域和地区性组织也制备标准品，如美国的疾病控制中心（Centers of Disease Control，CDC）、美国病理学家协会（CAP）的国家委员会（NationalCommittee of the College of American Pathologists）。国家卫生研究所（NationalInstitute of Health，NIH）提供尤其是用于研究目的的多肽激素标准品，IFCC也已组织制备了一种脂蛋白和血清蛋白的标准品，其可通过CAP得到，国际癌发生生物学和医学学会（International Society of Oncodevelopmental Biology and Medicine）已起动一个肿瘤标志物的决定基绘图计划。在国内中国药品生物制品检定所提供一些多肽激素、肿瘤标志物等标准品，卫生部临床检验中心则为全国各级临床实验室提供室内质控物。尽管仅仅是使用标准品并不能保证肿瘤标志物测定结果的可比性，但标准品对保证肿瘤标志物测定的重要性是不言而喻的。目前在世界上有各种不同的科学协会如IFCC、国家临床实验室标准化委员会（National Committee of Clinical Laboratory Standardisation，NCCLS）以及美国和加拿大临床化学协会（American Societies for Clinical Chemistry and Canadian Societies forClinical Chemistry and Canadian，AACC和CSCC）等正致力于免疫测定的标准化工作，这些组织也制备一些标准品。在美国，免疫测定必须有食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准。在德国的监督机构是医学实验室标准化和文件化研究所（Institute for Standardisation and Documentation in MedicalLaboratories,INSTAND）。在国内免疫诊断试剂的审批由国家药品监督管理局（SFDA）负责，卫生部临床检验中心也正在着手临床免疫检验标准化方面的工作。

        临床实验室测定的标准化关键在于测定结果的量值溯源，实现量值溯源的手段，一般可通过参考方法（或参考测量程序）和标准物质来进行。大部分肿瘤标志物均没有参考方法，有标准物质的亦不多，故通常只能通过各试剂生产厂家的标准来确定量值，其标准化就相当困难。下面主要谈一谈AFP、PSA和CEA测定的标准化问题，这3种标志均已有国际标准物质。

        AFP由于其具有相对的肝脏特异性，在临床上主要用于原发性肝癌的高危人群的筛查、辅助诊断、疗效和治疗及复发监测等，此外还可用于妊娠中三月胚胎21-三体型（Down氏综合症）的母体筛检。用于原发性肝癌的筛查和辅助诊断，虽不要求有非常准确的量，但确定正常与异常间的临界值（cut-off）对于其临床应用还是很重要的。不同厂家试剂、不同方法间的临界参考值有可能不一样，这就需要在建立方法时，用大量的实验及标准品来证实。AFP用于Down氏综合症的筛检更需要AFP测定的标准化，因为筛检时，在妊娠的每一周，都要将AFP的浓度转换成一参考人群中值的倍数，因此在测定校准上的小的差异都会对后面危险因子的计算有很大的影响，故每一个筛检实验室都必须分别建立其自己的参考值。AFP国际标准物质（IS）1 IU大约相当于1.2μg。

        PSA是一种分子量为30K的丝氨酸蛋白酶，当其进入血液循环时即与蛋白酶抑制物形成复合物，血清中约50-98%免疫反应性PSA以与α1-抗胰凝乳蛋白酶（ACT）结合的形式存在，其余大部分是游离的，少部分与α1-抗胰蛋白酶结合，血清中还含有用通常的免疫测定方法测不出的PSA-α2-巨球蛋白（AMG）复合物。目前已有的PSA测定方法对PSA-ACT的测定能力各有不同，在该复合物中有一些PSA的决定簇被ACT所覆盖，从而导至其与多克隆抗体的反应性降低。目前PSA的免疫测定几乎均使用依据两个单抗或一个单抗和一个多抗的双抗夹心模式，后者常造成PSA-ACT测定结果偏低，但使用某些单抗时亦如此，在某些测定方法中，通过将其与一个平衡测定两种成份的方法进行比对校准而对原方法的偏低结果进行补偿。PSA测定的另一个问题是校准品的基质，如果将纯化的PSA加入至血清中，将形成与ACT和AMG的复合物，但由于PSA试验不能测定PSA-AMG复合物，于是有大约30%-45%的PSA不能测出，因此应使用血清作为PSA校准品的基质，这样才能反映PSA在血液中的真实情况。一个国际合作研究研制了一个PSA标准物质，该标准物质由10%游离PSA和90%PSA-ACT组成，使用该标准物质校准的测定试验给出了相似的结果，尽管其并没有以等摩尔的方式测定每一种形式的PSA，使有这种标准物质可迅速地改善不同测定试验之间结果的可比性。由于在前列腺癌患者中PSA-ACT所占总PSA的比例远高于良性前列腺疾病，因此可通过分别测定PSA和PSA-ACT，然后计算其比例而提高PSA测定的诊断价值，故而有必要对这两种形式的PSA分别制备标准物质。临床上PSA的测定现已越来越多地用于前列腺癌的筛查，在测定校准上的微小差异也会对筛检为阳性的男性的数量有较大的影响，因此PSA测定的标准化极为重要。

        由于CEA有一族相关的抗原，因而其特异的测定较为麻烦。例如，正常交叉反应抗原（Normal crossreacting antigen, NCA）由粒细胞所产生，在血循环中以相当高的浓度出现。NCA-2是CEA的一个胚胎性（糖基化）变异体，此二种抗原均由成人和胚胎结肠粘膜所产生，在某些癌症患者，所产生的CEA部分是胚胎型（NCA-2）的。目前已有的CEA测定试剂与NCA无甚交叉反应，但与NCA-2则有不同程度的反应性，这一点以及CEA的不均一性说明了在不同CEA测定试剂间的差异存在的原因。已有CEA的国际标准物质，但其一般以质量单位表示，尽管第一代国际标准品IRP73/601使用的是IU/L。