（讨论帖）一篇行业标准里面的引物之技术分析

huangchj03

今天阅读文献时看到一对关于鸭源鉴定的taqman的引物，出处是行业标准SN/T 2727-2010《 饲料中禽源性成分检验方法-实施荧光PCR法》，于是我又找到了该标准，仔细并核实了一下，发现了一些端倪，我现根据我的知识体系分析一下，希望技术宅们也帮着分析一下，如果我有不对的地方，一定要不吝赐教！

   引物如下： F：aagccttcctctagctcagc / R：agaaaatgctttagttaagtc / P：ctcagccgcttaaacaacgc
     我现采用NCBI数据库blast一下，基本上该引物在特异性上问题不大，仅下游完全匹配的数据较少，但是由于没有深入比对，在特异性上应该没有致命问题。数据如下：   
上游：

   

下游：

探针：

       继续分析，采用引物设计软件Primer express 3.0分析一下引物的二级结构，结果令我大吃一惊，详见下图分析。

      分析如下：
1、上游引物的Tm值为54.4℃、下游引物的Tm值为48.9℃、探针的Tm值为59.6℃。根据Taqman探针设计原理，上下游引物的Tm值应该在60±2℃，并且两引物的Tm相差不应超过2℃，最多不能超过4℃，很明显这对引物在Tm值这一项上不合适，第一是上下游引物的Tm均偏低，尤其是下游引物，第二是两引物间Tm相差5.5℃，相差较大。
2、 根据Taqman探针设计原理，Taqman探针的Tm值应该在70℃，并且要比上下游引物的Tm值至少高5℃，很明显，该探针的Tm值仅59.6℃，与原理要求相差10℃，也不满足Taqman探针的设计原理。
3、下游引物GC%明显偏低，仅29% ，低于引物设计原则要求的40%-60%，甚至低于引物设计的下限-30%。
     继续分析二级结构 ，下游引物自身dimers和下游引物与探针之间的dimers 均偏在3‘端，影响扩增效率！详见下图：
上游引物发卡：     上游引物自身dimers：   上游引物与下游引物dimers：   上游引物与探针 dimers：         

下游引物发卡：        下游引物自身dimers： 下游引物与探针 dimers：      探针自身dimers：

       由于Primer express 3.0软件，只能看到部分二级结构，因此我决定采用软件primer premier 5.0继续分析，
首先看一下上下游引物的结果。首先再次印证了上下游引物的Tm值存在的问题，上游引物Tm为55.9℃，下游引物的Tm为46.3℃，扩增片段长度为80bp，下游引物GC%含量为28.6%，这和Primer express 3.0软件分析一致，该软件有得分功能，上游引物得分69分，下游引物得分65分，两引物组合得分43分，很明显，不及格！见下图。

我们再看看这两条引物的二级结构：
上游Dimers：                                            

上游假引发：         

上游引物与下游引物Dimers：

下游引物发卡：              

下游引物Dimers：

下游引物假引发：   

因为这个软件只能两两分析，接着我们再分析探针和下游组合的情况，结果最令人吃惊的事情出来了，大家可以看到上游引物的定位是16s 第1-20个碱基，而探针的起始碱基却是第15个碱基，探针居然与上游引物重叠了6个碱基！即重叠了CTCAGC，大家可以再看看引物序列！这正常吗？Taqman设计原则不是说探针距上游引物3’端1-5bp为最佳吗？！从来没有听说可以重叠，并且重叠6个碱基呀！高手们，这样可以吗？求大神指点。采用该软件得到的探针的Tm为61.2℃，基本与Primer express 3.0软件一致！

                                              探针Dimers:                             下游引物与探针Dimers：
                                  
       本着我专业上的兴趣爱好我继续分析这对引物，于是我将NCBI数据库与鸭科相关的16s RNA序列下了下来，同时将猪、牛、羊等物种的16s RNA 也附带上，我先用MeGa 3.0 blast一下，然后看看这对引物特异性到底怎么样？结果显示，下游引物第9个碱基在部分鸭亚型上存在错配，但不影响扩增。特异性良好！
上游blast结果：

  

探针blast结果：

下游引物blast结果：

下图为这对引物在16s RNA上的示意图。

     原文中的数据图，文献名称为《鸭肉冒充牛羊肉的分子生物学检测》，这个数据图看起来真的很漂亮，不由的我不怀疑我的知识体系，以及所谓的Taqman探针设计原则呀！

我对这对引物的分析基本结束，总结一下有以下疑问：
1、Taqman探针法设计原则中的上、下游引物Tm值真的不重要吗？可以偏差在15℃以上吗？
2、 上游引物可以与探针重叠吗？并且重叠6个碱基！
3、设计引物的时候的不用考虑假引发的影响吗？即使引物与目标片段内部有严重的配对现象？
4、这对引物可是出现在国家出入境检验检疫局的行业标准中的，难道我又发现了什么吗？如果公务员做的行业标准是这个水平的话，我觉得对不起我们纳税人的钱呀！
开此贴只为交流，我确实没有设计过上下游引物Tm值偏差很大的引物，也没有设计过探针与上游引物重叠的Taqman组合，所以缺乏这方面的实验经验，这对引物探针是否可行？求大神指点！

兰州安康伯乐生物技术有限公司技术总监  黄超杰

空白派

版主，QQ空间看来不支持外链被引用哈。图裂了。。

huangchj03

空白派 发表于 2014-7-16 22:03
版主，QQ空间看来不支持外链被引用哈。图裂了。。

那我明天在整理一下

xiahou212

我是来学习的，不要沉啊

jodebouch

以前听说过有人怕泄密，发文章时故意不用真实的引物。

huangchj03

这个讨论有答案了，这篇行标困扰了我很久，于是我设计了几个实验简单的验证了以上几种情况，基本上可以回答这个问题了，首先这篇行标的引物和探针应该问题不大，我通过实验验证了上游引物与探针重叠的情况，发现重叠1个、3个、5个、6个碱基对扩增均没有影响，这一点与很多设计原则就发生了违背，所以尽信书不如无书！我将上下游引物Tm值调整到50℃，结果扩增效果反倒更好，效率反倒更高；同时我设计了上下游引物3‘端引物存在严重二级结构的引物，对比发现仅仅推迟了不到1个循环。因此这篇行标没有问题，需要进一步讨论的同行可单独详谈

梅阿查

基本不怎么信引物探针设计原理了，太多和原理相冲突的实例了，基本不看二级机构什么的啦

梅阿查

被坑过几次，俺就醒悟了

huangchj03

所以说原理仅供参考，有些条款还是很重要的，被坑的多了就知道真正的原理是什么了，有些只可意会不可言传了

christian

那就是说引物设计可以更加随意了