药明康德：二代测序质量太高引发的“甜蜜烦恼”

莺歌燕舞

追求高了还要更高的二代测序数据质量，是药明康德基因中心的客户服务宗旨，其实这也是所有科学家、研究员的愿望。在药明康德，我们投入大量时间、精力和专业知识，深入理解二代测序技术原理，细致用心地完成每个项目，使我们的数据质量持续、稳定地保持在高水准。

照说，既然数据质量好，我们和客户都皆大欢喜才是。可是最近，我们却遭遇到了由于数据太好而引起客户疑问的“甜蜜的烦恼”。

这是怎么回事呢？原来，当我们递交数据后，满以为项目顺利结束，没想到却收到完全出乎意料的客户反馈：“数据是不是被删减过？我们要原始数据。”

仔细了解情况以后，我们发觉老师提出这样的疑问题其实也不过分，反而是很自然、也很有道理的。与他们以前从别的实验室拿到的二代测序数据相比，疑问主要有两个：首先，HiSeq 2000测序的数据集，正常情况下会有一些开头和末尾第一个碱基为N的序列，每条lane会有数千至数万条这种序列，除第一个碱基外，后面碱基的Phred score都还比较高，而在我们的数据中，没有这一特征；其次，用HiSeq 2000测定模式生物基因组，然后将测序数据mapping回其本身的基因组，mapping率通常在75%~80%左右，有20~25%的序列是不能mapping回去的，而我们数据的mapping率达到了95%以上。

难怪老师不相信。难怪老师要怀疑数据经过了删减，不是原始数据。

药明康德基因中心的规则就是把原始数据提供给客户。蓦地面对这样的问题，一时间我们还真有点不知道怎么办才好。想来想去，仅仅自己说自己的数据好，说数据没有经过加工和删减，从机器上下来就这么好，说服力不强。我们只好求助原厂，求助Illumina，将不涉及项目保密的资料递交给Illumina生物信息学专家，请他进行验算核实。

Illumina专家行事严谨，处理问题高效。他向我们索要了可以拿到的全套文件，包括SAV数据、config.xml文件以及数据转换合并的脚本等，检查了方方面面，得出结论：这批数据并无遗漏任何tile；除了PF之外，也没有进行其他QC加工。

针对老师提出的上面两点疑问，Illumina专家既提供了他的看法，并且还进一步向我们提出了一些老师没有想到的问题。这些解答和问题，值得我们细细体会，深入学习。

首先，“第一个碱基为N”并非正常情况。只有特定版本的HCS软件，比如说v2.0.5，由于软件存在bug，才可能会出现第一或者倒数第一个碱基为N的序列。也就是说，这是软件运算的问题，测序没有问题，而且还不一定每次都出现。

我们用的正是v2.0.5的HCS软件。既然数据中没有N，那是不是我们在测序的时候增加了循环次数，从而规避了这个问题呢？不是的。药明康德基因中心严格执行标准操作规程，不增加额外的循环。比如，合同规定进行2X100个循环的Paired-End测序，我们就测序2X101个循环。多出来一个循环是行业标准做法，也是Illumina官方建议的；除此之外，不再增加循环次数，不做2X102个或更多个循环。

另外，“每条序列的前面几个碱基的质量评分很低”也不是一定的。如果文库的碱基复杂度高，簇密度又控制得好，则前面几个碱基的质量评分也可以达到比较高的数值。碱基质量，包括前几个碱基的质量评分高低，与文库构建的好坏有关，比如试剂的质量和操作水准；也与软件进行数据分析的参数估算有关，比如簇密度和碱基复杂度。

药明康德基因中心并不追求前面几个碱基的质量评分，根本不关心它们是高是低，完全没有把它们看成是评价一个测序好坏的指标。但是我们的确在从文库构建到上机测序等各个环节都下了大功夫，积累了丰富的经验。测序数据质量高，其实得益于此。

第三，提高碱基质量评分，还有一个办法是修改recipe，改变实验流程。不过，药明康德基因中心的企业文化是严格执行SOP，我们不修改recipe。

最后，测序数据mapping率太高的问题，其实不需要我们站出来饶舌。出于药明康德全公司范围的严格的IP保护政策，我们在开展项目时遵循“最少信息原则”，根本不知道此客户的样本来自何种生物，因此也没有可能对数据进行针对性的加工，来提高mapping率。正如Illumina专家所指出的，mapping率高低与数据质量有关，也受比对方法、比对参数前后是否有差异、或者是否使用了不同版本的参考序列等因素影响。

来源：药明康德陈云地