测序那点事儿

千姿百态

2013年11月19日，两度诺贝尔奖获得者弗雷德里克•桑格（Frederick Sanger）在剑桥一家医院熟睡中安然去世，享年95岁。人们不禁唏嘘：即便是窥破了生命密码的科学伟人，也终要遵循生命的规律。在时间面前，人人都是平等的。

生命有“两套”天书，一套藏在蛋白质的序列间，一套藏在DNA的序列间。1955年，在剑桥大学做博士后研究的桑格将胰岛素中的氨基酸排列顺序测了出来，证明蛋白质具有明确构造，开创了生命第一套“天书”的破译工作。由于这项工作，桑格获得了1958年的诺贝尔化学奖。

1962年，桑格参与剑桥大学分子生物学实验室的筹建，却拒绝担任行政要职，理由是“参与管理事务太痛苦了”，后来，他把所有精力转移到了一个新的研究领域——DNA测序。

在桑格之前，同样在剑桥大学，沃森、克里克的工作已经表明：DNA是一种信息分子，生命的遗传信息记录在它不同的核苷酸排列顺序里。给DNA测序，搞清楚DNA上的核苷酸排列顺序，是探索生命本质的基础。

DNA测序是一件目的很简单但方法很复杂的工作。目的简单是因为DNA就像一本书，遗传信息逐字逐句地记录在它的分子结构里，我们要做的只是把信息读出来而已。艰难之处在于，这本书是微观的，我们无法凭借肉眼或一些简单的工具进行阅读，而只能借助于生物化学反应。

起初，桑格借鉴了他为蛋白质测序的方法，即通过打断DNA，把长短不同的碎片搜集起来进行分析。但他始终找不到一种合适的办法打断DNA。后来，他反其道而行之，想出了利用“DNA合成”进行测序的方法。

桑格的思路很精巧：以待测DNA为模板，进行DNA合成，在合成所需的原料里混入少量特殊的人造原料，这种特殊原料一旦连接到正在合成的DNA上，就会阻断DNA继续合成，由此会得到长短不一的以人造原料为末端的DNA片段，用凝胶电泳的方法将这些DNA片段从长到短排列出来，用放射性同位素自显影的方法依次读出末端的人造原料，就等于读出了待测DNA的序列。

这种特殊的人造原料——四种双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）是Sanger测序法的核心。我们都知道，DNA是由四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）分子排列而成的，ddNTP比dNTP少了一个氧原子，使得DNA的合成在ddNTP乱入后终止。同时，ddNTP用同位素进行了标记，可以很方便地读出ddNTP的种类。

1980年，桑格因发明“双脱氧链终止法”再次获得诺贝尔化学奖，成为继玛丽•居里（Maria Curie）、莱纳斯•鲍林（Linus Pauling）和约翰•巴丁（John Bardeen）之后的第四位两次诺奖获得者。

谦逊而低调的桑格大概不会承认，他的发明开创了一个时代。

从1977年Sanger测序法问世，在长达30年的时间里，sanger测序法作为第一代测序技术的标志，一直统治着DNA测序行业。在这期间，第一代测序技术不断发展，亦有新的技术诞生，例如第二代测序技术的雏形焦磷酸测序法、连接酶测序法等，但都撼动不了Sanger测序法的霸主地位，只是随着时间的推移，Sanger测序法的硬件进一步完善、流程更趋于自动化。比如在80年代中期，同位素标记法被荧光标记法取代，可以被照相和计算机系统自动辨别。到1996年，凝胶电泳的形式升级为毛细管电泳，将DNA测序限制在一条条封闭的毛细管里，相互间不会干扰。

1987年，第一台自动测序仪投入商业使用，3年后，以此为工具的国际人类基因组计划启动。Sanger测序法丰功累累，以377、MegaBACE、3730为代表的第一代测序仪，完成了包括国际人类基因组计划、水稻基因组计划、国际人类基因组单体型图计划在内的多项重大科研成果。

即便是2006年之后，第二代测序技术迅速上位并占据市场，Sanger测序法依然以其方便灵活、成本低、读长大的优势继续为人类的科学事业服务着。虽然，终有一天，Sanger测序法会被彻底取代，但它的功绩将永远铭刻在历史中。

当然，我们也必须承认：在时光漫步到新千年后，Sanger测序法通量低、时间长、成本高的劣势随科学界对测序需求的上升而凸显出来，大规模基因组学研究和应用遭遇了技术的羁绊。

事实上，从人类基因组计划启动的第一天起，科学家们就在寻求一种更好的方法进行基因组学研究，譬如有人试图将Sanger测序移植到芯片上，以实现大规模测序，但均以失败告终。

1987年，Nyren等人发明了焦磷酸测序法，这是一种理论上可以实现对大量DNA样品同时进行测序的技术，但由于受硬件、试剂等限制，一直无法很好地应用，直到美国人乔纳森•罗斯伯格(Jonathan Rothberg)博士的开创性发明。

1999年，一直从事测序技术研发的罗斯伯格的二儿子出世了，为此他暂时放下工作，休了两个星期的陪产假，但小家伙在出生后呼吸困难，立即被送入了婴儿特护病房。罗斯伯格非常担心，他甚至想获取儿子的基因组信息，以期找到儿子患病的原因。当然，在人类基因组计划都未完成的年代，他的想法很超前，但无法实现。

这段经历刺激了罗斯伯格，也给了他灵感。在医院候诊室里，他联想到基因测序和微电子之间的相似性，意识到可以按照这一思路去改进被埋没多年的焦磷酸测序技术。陪产假结束后，罗斯伯格立即投入到新型焦磷酸测序法的研发中。

2005年，罗斯伯格创立的美国454生命科技公司推出了基于焦磷酸测序法的高通量基因测序系统——Genome Sequencer 20 System，这如同一把利刃划破了基因组学的天空，自此，测序技术发生了翻天覆地的变化，由Sanger测序法支撑起来的第一代测序技术开始将帝王的权杖递交给以“边合成边测序”为核心思路的第二代测序技术。

454公司的测序仪推出后，无疑惊动了第一代测序仪的垄断者——377、3730等经典一代测序仪的制造商——美国ABI（Applied Biosystems）公司，ABI公司迅速收购了一家测序公司——Agencourt Personal Genomics，并在2007年底推出了SOLiD新一代测序平台。

之前从未涉足测序市场的美国Illumina公司也不甘示弱，在2007年花6亿美元收购了英国的基因测序公司Solexa，推出新一代测序仪Genome Analyzer。

在第二代测序技术诞生初期，454、ABI、Illumina三家公司呈三足鼎立之势，为了占领更广阔的市场，他们你追我赶，不断升级设备，使得测序成本进一步降低，测序通量进一步提高，极大地推动了技术的进步。

尽管天下三分，但所有第二代测序技术都有着如出一辙的流程：

首先，要对待测样本也就是DNA进行处理，通过物理、化学等方法将DNA样本随机打断成较小的片段，然后给DNA加接头，接头是人工合成的小段DNA，加接头可以起到标记作用，并能把DNA片段固定到测序载体上。不同的二代测序技术所用的载体不同，454的焦磷酸测序法和ABI的SOLiD测序法使用的载体是磁珠，Illumina的Solexa测序法使用的载体是芯片。载体将DNA片段束缚住后，DNA片段开始复制，一条DNA片段经过指数级扩增变成一“簇”DNA片段，相当于从一棵树变成了一片森林，这起到了信号放大的作用，好比我们在高空飞行，很难看到地面上一棵独立存在的树，却可以看到由很多棵树聚集成的森林。然后，就是二代测序最核心的部分——测序反应了。

测序反应说起来很简单，就是以待测DNA片段为模板，利用经典的碱基互补配对原则进行DNA合成。DNA合成时，dNTP一个接一个地加入到新的DNA链上，在这个过程中会出现一些光学、电压、离子等变化，例如，454的焦磷酸测序法所检测的信号是dNTP加入时释放出的焦磷酸分子，ABI的SOLiD测序法和Illumina的solexa测序法所检测的信号是dNTP加入时的荧光变化。通过捕捉这些信号，就可以判断出新链上的碱基加入顺序了。

由于信号是伴随着dNTP的加入依次释放的，所以二代测序法可以总结为“边合成边测序”。与之不同的是，一代的Sanger测序法是先进行DNA合成，待合成结束后再通过电泳的方法来确定碱基顺序。所以，相较之下，二代测序法节省了很多时间，而且无论是以磁珠还是芯片作为载体，都可以实现大规模并行测序，其通量要远远高于Sanger测序法所用的96根毛细管。

Illumina公司在2013年年底推出的第二代测序仪HiSeq X Ten测序仪运行一次需要3天，产生的数据量高达1.8T，相当于600个人类基因组大小。而一代测序仪中的终极版本3730运行一次需要两个小时，产生的数据量仅有80K，即便满负荷不间断运行3天，产生的数据量还不到3M，仅仅是HiSeq X Ten的60万分之一。所以，二代测序法也叫高通量测序法。

二代测序法三分天下的格局并没有持续太久。

2007年，美国罗氏（Roche）公司以1.5亿美元收购了454公司，454公司的创始人——454测序仪的发明者罗斯伯格“大神”则离开了454公司，从这之后，454测序日渐衰落。2013年，罗氏公司宣布454测序已经没有进一步发展的空间，决定关闭454测序业务，第二代测序仪的先行者自此退出了历史的舞台。

离开454公司后的罗斯伯格甚至没有喘息，马上又创办了Ion Torrent公司，并带着他的新发明——利用半导体方法进行基因测序的技术强势复出。和所有二代测序技术一样，Ion Torrent技术也是利用了“边合成边测序”，只不过它捕捉的信号是来自于半导体监测到的DNA合成时氢离子的变化。

与454的衰落相反，Illumina公司凭借其Hiseq系列产品通量高、成本低的优势，从二代测序仪市场的红海中杀出，逐渐崭露出二代测序仪制造商领头羊的姿态。华大基因于2010年购入128台Hiseq 2000测序仪，即反应了业界对Illumina产品的肯定。

另一大巨头ABI公司则在2008年年底与美国Invitrogen公司合并，将新公司命名为Life Technologies。随后，Life公司在2010年以3.75亿美元完成对Ion Torrent的收购，其测序业务从SOLiD转移到了Ion Torrent上，罗斯伯格仍然担任Ion Torrent团队的负责人。从2011年起，Life公司先后推出了Ion PGM（Ion Personal Genome Machine）和Ion Proton测序仪。

正所谓大鱼吃小鱼，2013年年底，“美国土豪”Thermo Fisher公司 136亿美元重磅收购Life公司，震动了整个业界。一时间，Thermo Fisher成为美国唯一能与Illumina公司叫板的二代测序仪制造商，美国的二代测序仪市场从三足鼎立演变为双雄争霸的局面。

与此同时，在工业制造一向不发达的中国，从来没有做过商业并购的华大基因，于2013年3月完成了对美国上市公司CG（Complete Genomics）的收购，强势进军测序市场。

在二代测序的战场之外，另一批科学家则开始探索基因测序的新方法——被称为“单分子测序”的第三代测序技术。

与第二代测序技术相比，第三代测序技术省去了DNA扩增的步骤，直接就可以对待测DNA样本进行碱基序列的读取，这进一步缩短了测序时间，并大大提高了测序读长。目前，第三代测序技术的代表有美国Helicos公司的单分子合成测序技术、Pacific公司的单分子实时测序技术以及英国Oxford Nanopore公司的纳米孔单分子测序技术。

来源：转化医学网

不过，现阶段的第三代测序技术在精确度上相比二代测序技术并没有任何明显优势，且性价比要远远低于二代测序技术，因此还无法实现大规模商业化，但不可否认，随着时间的推移，第三代测序技术终将支撑起测序行业的未来。

其实，从测序的目的来看，第三代测序技术是最接近于真实需求的，它从技术上实现了化繁为简，例如DNA样本不再需要复杂的前处理，不再为了放大信号而进行纯属多余的DNA扩增，并且拥有了更小的反应体系和更灵敏的检测方法。

测序技术的终极目标是无需样本前处理，更无需扩增，在全自动微流控下实现活细胞内的DNA测序。

说起来，DNA测序就是那么点事。你测或不测，DNA就在那里，38亿年来不离不弃