【CRISPR】助力全基因组的基因功能筛查

幸福侠侣

       2014年度的基因组生物学大会（The Biology Of Genomes）于5月6日晚在美国纽约冷泉港实验室召开。这是基因组学领域最重要的会议之一，吸引了多个著名研究所的科学家参加。此次大会的议题包括转化基因组学与遗传学、复杂性状的遗传学、癌症与药物基因组学、功能基因组学、计算基因组学等。

       Broad研究院的博士后研究人员Neville Sanjana在会议上介绍，他们利用CRISPR-Cas9介导的全基因组筛查，能够鉴定出与皮肤癌治疗耐药性相关的基因。

       在CRISPR-Cas9系统中，Cas9核酸酶在DNA位点上产生双链断裂，而这一位点是由短的向导RNA（sgRNA）决定的。这些断裂引入移码突变，产生功能丧失的等位基因。其他的基因组改造方法依赖蛋白质改造，而CRISPR-Cas9只需要一段短的RNA。因此，Sanjana认为，可编程性有了很大的飞跃。

       在这项研究中，Sanjana及其同事利用慢病毒在靶细胞中导入Cas9、sgRNA和选择标记。他们还开发出基因组规模的CRISPR敲除库，称之为GeCKO。这个库中包含近65,000个向导序列，靶定约18,000个基因。

       在检验GeCKO库时，研究人员关注了两种细胞系（A375癌细胞系和HUES62干细胞系）中对细胞活力至关重要的基因。两个星期后的深度测序表明，存活细胞中的sgRNA多样性大大降低，而许多被去除的sgRNA靶定核糖体结构成分及其他必需基因。这一研究成果已在《Science》上发表。

       之后，Sanjana及其同事将这种方法应用于黑色素瘤模型，以搜索与治疗耐药性相关的基因。他指出，在超过半数的黑色素瘤病例中，蛋白激酶BRAF发生突变，这个激酶调控MAPK信号级联，而大约70%的突变是V600E突变。BRAF抑制剂vemurafenib可靶定此突变，然而超过一半的患者最初对这种疗法有响应，但逐渐形成耐药性。

       为了找到逃避突变的基因，Sanjana及其同事将GeCKO库应用在黑色素瘤A375细胞系上。他们使用DMSO或药物治疗此细胞系，并在14天后搜索让细胞耐受治疗的变异。他们发现了之前与耐药性相关联的基因NF1和MED12，以及新的基因NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。Sanjana认为，这种筛查将为癌症研究人员带来新的线索。

       Sanjana还指出，他和他的同事们正在完善这种慢病毒CRISPR工具以及全基因组筛查库，预计本月晚些时候就可在Addgene中提供。Addgene是一个全球科学家共享质粒的非盈利组织。