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[分享] FISH(荧光原位杂交)技术解析

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发表于 2014-4-2 08:30:03 | 显示全部楼层 |阅读模式

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1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用,提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交,即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上,标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代,随着人类基因组计划的进行,由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

1、荧光原位杂交原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

2、荧光原位杂交特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,有以下特点。

荧光原位杂交优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

荧光原位杂交缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

3、荧光原位杂交实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。

4、荧光原位杂交应用

荧光原位杂交技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位,而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

荧光原位杂交技术最初用于中期染色体。从正在分化的细胞核中制备的这种染色体是高度凝缩的,每条染色体都具有可识别的形态,它们染色后将显现出特征性的着丝粒位置及染色带型。在处理中期染色体时,通过测定FISH所获得荧光信号相对于染色体短臂末端的位置(FLpter值)来进行作图。使用中期染色体的不足之处在于,由于它的高度凝缩的性质,只能进行低分辨率作图,两个标记至少分隔1Mb才能作为分开的杂交信号被分辨出来(Trask et al.,1991)。这种分辨率不足以构建有交往的染色体图谱。故此中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置,为其他更精细的作图方法做准备。 一直以来,这些“其他方法”并不包括任一种FISH,但1995年后,一系列高分辨率的FISH技术已发展起来。这些技术通过改变待研究的染色体制备的性质而达到较高的分辨率。中期染色体对于精细作图来说凝缩度太高,因而我们需要选用较为伸展的染色体。有两种途径可以满足这一要求(Heiskanen et al.,1996): 机械伸展的染色体(mechanically stretched chromosome)通过改变从中期细胞核中分享染色体的方法而获得。离心产生剪切力可将染色体伸展到正常长度20倍。每条染色体仍可识别,而FISH信号作图方法与通常处理的中期染色体相同,这样,分辨率可明显提高,能够区分出相隔200~300kb的标记。 非中期染色体(non-metaphase chromosome)染色体仅在中期高度凝缩,而在细胞周期的其他阶段保持天然未包装状态,有研究者曾利用前期细胞核,此时染色体凝缩程度足以区分出单个染色体。实际应用中,这种方法并无优于机械伸展的染色体之处。相比之下分裂间期(interphase)的染色体更为有用,因为分裂间期(再次细胞核分裂之间)的染色体包装程度最低。使用分裂间期的染色体,分辨率有可能达到25kb以下,但染色体形态特征消失,推动了定位探针位置所需的外部参照点。因此,该技术可在已获得染色体粗略图谱后使用,通常作为确定染色体一段小区域内一系列标记物顺序的方法。 间期染色体含有去组装的全部的细胞DNA分子。为了进一步提高FISH的分辨率到25kb以下,有必要放弃完整的染色体,而使用纯化的DNA。这种方法叫做纤维-FISH(fiber-FISH),利用凝胶拉伸或分子梳理技术制备DNA,可以分辨间距小于10kb的标记。


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发表于 2015-5-7 22:19:09 | 显示全部楼层
谢谢楼主的技术贴,像我所了解的北京安必奇生物科技正好就提供了几个疾病相关的检测试剂盒,包括HER-2基因扩增检测试剂盒、EGFR基因检测盒、前列腺癌细胞基因检测试剂盒、产前染色体数目检测试剂、BCR/ABL融合基因检测试剂盒。相关页面链接是http://www.abace-biology.com/FISH.asp,希望能够供大家参考。
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