FISH（荧光原位杂交）技术解析

青草

1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

1、荧光原位杂交原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

2、荧光原位杂交特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。

荧光原位杂交优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

荧光原位杂交缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

3、荧光原位杂交实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。

4、荧光原位杂交应用

荧光原位杂交技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

荧光原位杂交技术最初用于中期染色体。从正在分化的细胞核中制备的这种染色体是高度凝缩的，每条染色体都具有可识别的形态，它们染色后将显现出特征性的着丝粒位置及染色带型。在处理中期染色体时，通过测定FISH所获得荧光信号相对于染色体短臂末端的位置(FLpter值)来进行作图。使用中期染色体的不足之处在于，由于它的高度凝缩的性质，只能进行低分辨率作图，两个标记至少分隔1Mb才能作为分开的杂交信号被分辨出来(Trask et al.，1991)。这种分辨率不足以构建有交往的染色体图谱。故此中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置，为其他更精细的作图方法做准备。 一直以来，这些“其他方法”并不包括任一种FISH，但1995年后，一系列高分辨率的FISH技术已发展起来。这些技术通过改变待研究的染色体制备的性质而达到较高的分辨率。中期染色体对于精细作图来说凝缩度太高，因而我们需要选用较为伸展的染色体。有两种途径可以满足这一要求(Heiskanen et al.，1996)： 机械伸展的染色体(mechanically stretched chromosome)通过改变从中期细胞核中分享染色体的方法而获得。离心产生剪切力可将染色体伸展到正常长度20倍。每条染色体仍可识别，而FISH信号作图方法与通常处理的中期染色体相同，这样，分辨率可明显提高，能够区分出相隔200~300kb的标记。 非中期染色体(non-metaphase chromosome)染色体仅在中期高度凝缩，而在细胞周期的其他阶段保持天然未包装状态，有研究者曾利用前期细胞核，此时染色体凝缩程度足以区分出单个染色体。实际应用中，这种方法并无优于机械伸展的染色体之处。相比之下分裂间期(interphase)的染色体更为有用，因为分裂间期(再次细胞核分裂之间)的染色体包装程度最低。使用分裂间期的染色体，分辨率有可能达到25kb以下，但染色体形态特征消失，推动了定位探针位置所需的外部参照点。因此，该技术可在已获得染色体粗略图谱后使用，通常作为确定染色体一段小区域内一系列标记物顺序的方法。 间期染色体含有去组装的全部的细胞DNA分子。为了进一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放弃完整的染色体，而使用纯化的DNA。这种方法叫做纤维-FISH(fiber-FISH)，利用凝胶拉伸或分子梳理技术制备DNA，可以分辨间距小于10kb的标记。

candygreen

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