NGS样品制备指南之RNA篇

青草

在经历了几年的高速发展之后，新一代测序仪终于放慢了脚步。如今，样品制备成为NGS中新的亮点。新试剂、新仪器不断涌现，以缩短时间，提高通量。同时，新方法也在不断被开发，以处理更少的样本，如单细胞。这一次，生物通带您走近NGS的样品制备，看看有哪些新工具能帮助我们应对样品制备的挑战。

高通量RNA测序（RNA-Seq）正成为最受欢迎的NGS应用之一。根据生物通举办的调查，在目前已开展新一代测序的参与者中，大约58%的人会使用NGS测序仪开展转录组测序。RNA-Seq能够在全基因组范围内以单碱基分辨率检测转录本，具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势，正成为研究基因表达和转录组的重要工具。

对于RNA-Seq而言，在决定如何制备文库前，首先要考虑测序实验的主要目的。如果目的是探索整体的转录事件，那么文库应捕获整个转录组，包括编码、非编码、反义及基因间RNA，尽可能完整。不过，许多研究的对象是编码mRNA转录本，那么只需要抽取出带poly(A)尾巴的RNA。当然，也有一些研究是聚焦小分子RNA，主要有miRNA、snoRNA、piRNA、snRNA等。

miRNA测序

NGS最早应用在RNA-Seq上的成功案例便是miRNA。miRNA测序文库的制备过程很简单，通常是单管反应。以Illumina的操作为例，首先将3’腺苷酸化的DNA接头添加到总RNA样品中miRNA的3’端。然后，在miRNA的5’端添加RNA接头。之后，连接产物经过RT-PCR扩增，引入多重分析的条形码，并产生测序文库。Ion Torrent的流程也相似，不过是在单个反应中连接两端的接头。

（图片来自Illumina）

据美国斯克里普斯研究所的Steven Head介绍，当起始RNA的量较少（总RNA< 200 ng）时，问题就来了。在RT-PCR反应中，短的接头二聚体会与目的产物竞争。当太多的接头二聚体存在时，它们涌入凝胶，污染产物条带。为了避免这一问题，许多miRNA文库制备试剂盒都采取了一些措施。

Bioo Scientific的NEXTflex&#8482; Small RNA测序试剂盒采用AIR&#8482;连接酶，这是一种截短的T4 RNA连接酶，能提高小RNA添加接头的效率，带来更高的测序深度。而创新的NEXTflex接头连接技术能减少接头二聚体的污染，产生更多、更高质量的序列read。利用一种专门的RT引物和缓冲液，3’和5’接头二聚体将不再占用宝贵的测序资源。

mRNA测序

对于mRNA测序文库的制备，大致过程如下：首先，用Poly(T)寡核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly(A)尾的RNA。将所得RNA随机打断成片段，再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段. 然后，对cDNA片段进行末端修复并连接测序接头，得到将用于测序的cDNA。一般还需要用电泳切胶法获取长度范围在200 bp（±25 bp）的cDNA片段，再通过RCR扩增，得到最终的cDNA文库。

Illumina的TruSeq RNA Sample Preparation Kit如今已升级到第2版。它为RNA文库的生成提供了一个简单而高效的方案。预混液试剂避免了大部分移液步骤，并减少了纯化的量，与过去的方法相比，最大限度地缩短了手工操作时间。

链特异的RNA-Seq

样品制备最终得到的是双链DNA文库。在测序过程中，每个read随机地来自双链cDNA中的某一条链，在后续的read定位时需要两个方向都考虑。对于某些研究而言，如长链非编码RNA（lncRNA）分析，转录本的方向对重要，需要在文库制备和测序中保留RNA的方向信息。

于是，目前也有一些保留方向信息的RNA-Seq样品制备方法被开发出。它们采取的策略是在第二链cDNA合成反应中掺入dUTP，从而选择性去除两条链中的一条。随后这条包含尿嘧啶的链被通过酶学方法去除（NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina），或利用不能识别模板链中尿嘧啶的PCR聚合酶，防止进一步扩增（Illumina TruSeq Stranded Total RNA kit）。此外，放线菌素D也常被添加到第一链cDNA合成反应中，以减少假的反义链合成。

单细胞RNA-Seq

RNA-Seq已广泛用于各种组织的基因表达分析，但是对于稀少或珍贵的样品，如干细胞、循环肿瘤细胞或活检组织，因样本量少，这还是个难题。为此，Illumina和Clontech合作开发出SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing。

这个试剂盒仅需要100 pg总RNA。大致过程如下：一个锚定的oligo-dT引物启动cDNA合成，并添加一个通用的引物序列。接着，SMARTScribe逆转录酶开始逆转录，并在cDNA的3’端添加一些额外的核苷酸。而精心设计的SMARTer Oligonucleotide与这些3’端核苷酸杂交，启动模板切换，让SMARTScribe逆转录酶继续复制。这样，产生的全长单链cDNA就包含完整的mRNA 5’端以及与SMARTer Oligonucleotide互补的序列，可通过PCR扩增。合成后的cDNA可直接用于Illumina测序文库的制备。

（图片来自Clontech）

就单个细胞而言，大约只含有10 pg总RNA，而poly(A) RNA更是低至0.1 pg。因此，从一个细胞中获得RNA数据？目前还有难度。现有的方法都需要某种形式的全转录本扩增，才能产生足够的材料，去制备测序文库。当然，这会产生明显的技术噪音，而这一问题至今尚无法解决。不过随着技术的进步，相信研究人员很快会找到破解之道。