| [/table]因此，生物分离过程往往成本很高，在某些产品的生产过程中，分离成本可能占到总成本的80％以上 |
|
| Thus the recovery and the purification processes must be well conceived and well designed.（因此必须仔细考虑和设计产品的回收和纯化过程） |
| We have found that our own designs have been improved by answering the following questions: （设计中应考虑下列问题） |
| （1）What is the value of the product?（产品价值） |
| （2）What is an acceptable product quality?（产品质量） |
| （3）Where is the product in each process stream?（产物在生产过程中出现的位置） |
|
| （4）Where are the impurities in each process stream?（杂质在生产过程中出现的位置） |
| （5）What are the unusual physicochemical properties of the product and the principal impurities?（主要杂质独特的物化性质是什么？） |
| （6）What are the economics of various alternative separations?（不同分离方法的技术经济比较） |
| Careful consideration of these questions can provide clues that will lead to optimal processes for the recovery of products of adequate quality coupled with high recovery and minimum effort. （上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化） |
| 六、生物分离的一般步骤 |
| From our experience, we find that most bioseparations have four similar steps: |
| （生物分离一般分四步） |
| 1、不溶物的去除（固液分离）Removal of insolubles |
| filtration、centrifugation、cell disruption (necessary when the desired product is intracellular.) |
| Relatively little product concentration or improvement of product quality occurs. （提高产物浓度和质量） |
| 2、杂质粗分（浓缩） |
| adsorption - ion-exchang（离子交换吸附） |
| extraction（萃取） |
| solvent extraction（溶剂萃取） |
| reversed micelle extraction（反微团萃取） |
| supercritical fluid extraction（超临界流体萃取） |
| aqueous phase extraction（双水相萃取） |
| These steps, which are relatively nonspecific, remove materials of widely divergent properties compared to the desired product. （以上分离过程不具备特异性，只是进行初分） |
| Appreciable concentration and product quality increases usually occur.（可提高产物浓度和质量） |
| 3、纯化 |
| chromatography（色谱） |
| electrophoresis（电泳） |
| precipitation（沉淀） |
| These processing technology are highly selective for the product and remove impurities of similar chemical functionality and physical properties.（以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性） |
| 4、精制 |
| crystallization（结晶） |
| drying （干燥） |
| 七、本章作业 |
| 1、生物分离工程在生物技术中的地位？ |
| 2、生物分离工程的特点是什么？ |
| 3、生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？ |
| 4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？ |
| 第二讲 过滤 2学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的内容 |
| 1、何谓过滤 |
| 2、过滤的基本形式 |
| 3、凝聚和絮凝的区别 |
| 4、常用的絮凝剂有哪些 |
| 5、过滤设备分类 |
| 6、常用过滤设备及其特点 |
| 二、过滤的基本概念 |
| 过滤是在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下，是固液分离的常用方法之一。 |
| Filtration separates solid from a liquid by forcing the liquid through a solid support or filter medium. This is a straight forward procedure for well defined crystals. |
| 三、过滤前物料的前处理 |
| However the small size of microorganisms make filtration of fermentation beers or other biological solutions considerably more complicated. Generally, fermentation beers and other biological solutions are notoriously hard to filter. They are often hard to filter because of high non-Newtonian viscosity or highly compressible cakes. That is to say, we must modified these procedures for bio-separations. |
| 通常发酵液和生物溶液是高粘度的和非牛顿流体，是很难过滤的，为了加快过滤速度，通常可采用以下方法： |
| 1、加热（Heating）——降低液体粘度 |
| 2、凝聚和絮凝（Coagulation and flocculation）——在电介质作用下，破坏溶质胶体颗粒表面的双电层，破坏胶体系统的分散状态，使胶体粒子聚集的过程 |
| 四、影响凝聚作用的主要因素 |
| Simple electrolytes act by screening the electrostatic repulsion, which commonly exists between colloidal particles. When this electrostatic repulsion is reduced, attractive London-vander waals forces predominate. The colloids can then coagulate as larger, dense particles which are more easily filtered. (简单电解质降低胶体间的排斥力。从而范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。) |
| 1、无机盐的种类 |
| 2、无机盐的化合价 |
| 3、无机盐的用量 |
| 常用的凝聚剂有： |
| Al2(SO4)3.18(H2O)，AlCl3.6(H2O)，FeCl3，ZnSO4，MgCO3 |
| 五、絮凝作用(Flocculation) |
| 概念：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 |
| Synthetic polyelectrolytes added as pretreatments can both reduce electrostatic repulsion and adsorb on adjacent particles, forming bridges between them. As a result, the colloidal particles flocculate as large, less dense aggregates which are more easily filtered. These polyelectrolytes can be anionic, cationic or nonionic.（合成助滤剂既降低静电斥力又吸附周围的微粒，形成桥架作用。胶粒过大，就发生絮凝，低密度聚合的胶粒，容易过滤。聚合电解质有阳离子型、阴离子型或非离子型。 |
| 六、常用的絮凝剂 |
| 1、天然聚合物 |
| 多糖类物质、海藻酸钠、明胶等 |
| 2、人工合成聚合物 |
| 聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类等 |
| 七、助滤剂 |
| 1、目的：助滤剂是一种具有特殊性能的细粉或纤维，它能使某些难以过滤的物料变得容易过滤 |
| 2、常用的助滤剂： |
| 硅藻土（Diatomaceous earths） |
| 珍珠岩（Perlites） |
| 八、General Theory for Filtration |
| Fluid mechanics for filtration Darcy’s law （Darcy方程）for incompressible cake, simplest case（适用于不可压缩和简单的可压缩滤饼）for compressible cake, common for bio-separations（普遍使用于生物分离过程。） |
| 1、Darcy’s law（达西定律） |
| •V=k △P/μl (2.1) |
| •where |
| V－velocity of the liquid |
| • k—proportionality constant (usually called the Darcy’s law permeability of the bed) （K比例常数,过滤床渗透性的达西方程参数）） |
| △P－the pressure drop across the bed of thickness （压降） |
| μ－ viscosity of the liquid （流体粘度） |
| *当Re<5时达西定律才成立 |
| •For batch filtration the velocity is（板框式过滤流速方程） |
| • V=(1/A)*dV/dt (2.2) |
| A－filtration area （过滤面积） |
| V－the total volume of filtration（滤液总体积） |
| t－the filtration time（过滤时间） |
| •有 |
| l/k= Rm + Rc （2.3） |
| Rm——the resistance of the filter medium RM （过滤介质的阻力） |
| Rc——the resistance of accumulate cake bio-mass （滤饼的阻力） |
|
| 2、Incompressible Cakes（不可压缩滤饼） |
| If the cake is in compressible (rigid), the cake thickness is directly proportional to the filter area. （不可压缩滤饼厚度正比于过滤的体积） |
| As a result the cake’s resistance Rc is |
| Rc=αρo(V/A) (2.4) |
| •where |
| α－represents the specific cake resistance （滤饼的阻力特性） |
| ρo－the mass of cake solids per volume of filtrate （单位体积滤液含固体滤饼量） |
| 3、Compressible cake（可压缩的滤饼） |
| Almost all cakes formed of biological materials are compressible, and so cannot be described with the simple equation just outlined. As these cakes compress, filtration rates drop. （大多数生物滤饼都可压缩，不能仅用作图法描述，滤饼可压缩，则过滤速度降低） |
| •α=α’(△P)s |
| •Where |
| α’－a constant related largely to the size & shape of the particles forming the cake.（α’与粒子大小和形状相关） |
| S － the cake compressibility |
| （s是压缩系数） |
| S=0 a rigid & highly incompressible cake （理想的不可压缩s=0） |
| S=1 a highly compressible cake （高度可压缩 s=1） |
| S=0.1-0.8 in practice （变化范围从0到1） |
| Values of S & α’ are most easily determined by plotting the logarithm of αversus the logarithm of △P as shown in fig.(2.1)（计算s和α’可用logα对log△P作图） |
| 九、Continuous Rotary Filter 连续旋转式过滤机 |
| We analyze the operation of these units, a filtration cycle on this filter consists of three chief （过滤有三步组成） |
| 1、cake formation（滤饼的形成） |
| 2、cake washing to remove either or unwanted solutes（滤饼的洗涤） |
| 3、cake discharge（滤饼的卸下） |
| we assume that the resistance of the filter medium Rm is negligible, so that we can use equation (2.5)（假设滤饼阻力不计），the basic expression for filtration |
| (1/A)*dV/dt = △P/(μ Rc) |
| initial condition that（初始条件是） |
| t=0 v=0 |
| Rc = αρo (V/A) |
| =α’ρo(V/A)( △P)s |
| tf=(μαρo/(2△P1-s))*(Vf/A) |
| tf—— the cake formation time （滤饼形成时间） |
| Vf——the volume of filtrate collected during that period.（滤液流量） |
| *cake washing（滤饼的洗涤） |
| 作用： |
| （1）First, it displays the solution-rich broth trapped in pores in the cake.（将滤饼内发酵液洗出） |
| （2）Second, it allows diffusion of solute out of the biomass in the cake. Such diffusion will enhance recovery, if the desired product is in the biomass.（扩散出生物有机体，这对目标产物在生物有机体很有用） |
|
| 八、过滤设备及其结构 |
| 过滤设备的分类 |
| 根据推动力的不同可分为四类 |
| （a）重力过滤 自然过滤 |
| （b）加压过滤 板框过滤 |
| （c）真空过滤 真空过滤器 |
| （d）离心过滤 离心过滤器 |
| 九、过滤介质 |
| 1、无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤 |
| 2、成形颗粒：烧结金属、烧结塑料 |
| 3、非金属织物：尼龙、玻璃纤维 |
| 4、金属织物：不锈钢丝网 |
| 5、无纺品：纸、石棉 |
| 十、典型的过滤设备 |
| 1、板框压滤机 |
| 优点：结构简单、过滤面积大、操作压力高、适用范围广 |
| 缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、辅助时间长 |
| 2、旋转过滤机 |
| 可实现连续操作 |
| 十一、本章作业 |
| 1、何谓过滤 |
| 2、过滤的基本形式 |
| 3、凝聚和絮凝的区别 |
| 4、常用的絮凝剂有哪些 |
| 5、过滤设备分类 |
| 6、常用过滤设备及其特点 |
|
| 第三讲 离心与沉降 2学时 |
| 一、通过本章学习应该掌握的内容 |
| 1、何谓沉降 |
| 2、沉降与离心的异同 |
| 3、沉降与离心的速度方程 |
| 4、离心设备可分为哪两大类 |
| 5、常用的离心沉降设备有哪些 |
| 6、常用的离心过滤设备有哪些 |
| 二、离心的概念 |
| The first step in most industrial bioseparations is the removal of insoluble solids from the fermentation beer. The concentration and size of these in solubles varies widely. （生物分离首先去除不溶物） |
| The size ranges from microorganisms of perhaps 1 um diameter up to insoluble nutrients characteristically 1mm in diameter（粒径从1um的到1mm） |
| When these insolubles are dilute, large & rigid, they can be easily separated by filtration. In the previous chapter, we described filtration, including the use of filter aids. For many beers, these filter aids facilitate filtration. For other beers, filter aids are ineffective.（不溶物浓度小，粒径大，硬度强时用过滤分离。使助滤剂过滤分离，对一些发酵液很有用） |
| When the beers are not easily filtered, they sometimes can be separated by centrifugation, which is the subject of this chapter.（不易过滤可用离心） |
| Centrifugation requires more expensive equipment than filtration. However, it is often effective way even when the solid particles are small & hence hard to filter. |
| 基于固体颗粒和周围液体密度存在的差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程 |
| 实际上离心和过滤一样，也是固液分离的一种单元操作 |
| 对于一些固体颗粒小、溶液粘度大的生物体系，过滤实际上是很难进行的，必须采用离心技术方能达到目的 |
| 三、沉降的概念 |
| 沉降：是指当悬浮液静置时，密度较大的固体颗粒在重力的作用下逐渐下沉，这一过程成为沉降 |
| 沉降过程通常是十分缓慢的，对于一些固液密度差异很小的体系沉降往往需要很长时间 |
| 四、沉降速率方程 |
| When a solid particle moves through an infinite continuum, its velocity is affected by two forces. |
| 当一固体微粒通过连续介质时，它的运动速度受到两种力的作用： |
| 1、由于密度差引起的浮力 |
| 2、微粒受到的流体阻力 |
| 当浮力与阻力达到平衡时，该微粒以恒定的速度沉降 |
| 联立二式可得沉降速率方程： |
|
|
| 五、重力沉降式液固分离设备 |
| 1、特点： |
| 设备简单、运行成本低、能耗低 |
| 体积庞大、分离效率低 |
| 2、传统的沉降设备： |
| （a）矩形水平流动池 |
| （b）圆形径向流动池 |
| （c）斜板与斜管式沉淀池 |
| 六、离心式沉降分离 |
| 1、分类： |
| （a）离心沉降 |
| （b）离心过滤 |
| 2、离心沉降 |
| 利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离 |
| 操作方式：间歇式、连续式 |
| 型式：管式、套筒、碟片式 |
| （1）管式离心机（Tubular bowl） |
| Simple yet, can provide a very high centrifugal force.（最简单，可提供较大离心力） |
| Tubular centrifuges can be cool, a real advantage in protein work.（可用冷却水冷却），Suspension is usually fed through bottom, and clarified liquid is removed from the top.（悬浮液由管底进，澄清液由管口流出） |
| 离心过程分析： |
| To begin this analysis, assume that this typical particle is located at |
| (1) A distance Z from the bottom of the centrifuge as show in Fig 3.2.1. |
| (2) Located at position r from the axis of rotation.（离旋转轴为r的微粒） |
| (3) This position is between the liquid surface R1 & the bowl radius R0.（位于液体界面半径r1和管心半径r0的微粒 ） |
| The particle is moving in both the Z & r directions. |
| Its movement in the Z direction comes from convection of the feed pumped in the bottom of the centrifuge: （Z方向的动力来源于离心机底部泵入料液的对流） |
| dz/dt=Q/[π(R02-R12)] (3.8) |
| Where Q is the feed flow.（料液流速） |
| The eq(3.8) implies that gravity has only a negligible effect in the Z direction.（ Z方向重力可忽略） |
| We will assume that the centrifugal force is so high that the liquid interface R1 is constant, independent of Z.（假定离心力很大，R1是常数） |
| The particle movement in the r direction is related to its radial position r by (3.7).（r方向上运动与半径r有关） |
| dr/dt= d2(ρs-ρ)rω2/(18μ) (3.9) |
| We will rewrite this eq. In terms of the velocity of a particle settling under the influence of gravity: |
| dr/dt=νg(rω2/g) (3.10) |
| Whereνg is velocity given by Eq.(3.6). |
| We combine (3.8) & (3.9) to find the trajectory of a particle within the centrifuge:（得出离心机内部微粒的运动轨迹） |
| dr/dz=(dr/dt)/(dz/dt)=νg(rω2/g)π(R02-R12)/Q (3.11) |
| （2）碟片式离心机（Disc type centrifuge.） |
| dx/dt=ν0-νcsinθ (3.15) |
| ν0=[Q/(2πrln)]f(y) （3.16） |
| n--- the number of discs（蝶片数） |
| r--- the distance from the axis of rotation（微粒与转鼓轴线间距离） |
| l--- the distance between discc |
| f(y)--- some function giving the velocity variation across the distance between discs . （蝶片间流速变化的函数） |
| 3、离心过滤 |
| 使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 |
| This is the third, centrifugal filtration; the basket unit shown in fig 3.2-1 d. is really a combination of a centrifuge & a filter. It consists of a perforated basked which rotates rapidly. Suspension is again fed along the axis of the bowl & solid accumulate on the wall of the basket. |
| We begin the analysis by recalling that the pressure drop Δp in a flat cake is proportional to the fluid velocity v through that cake : |
| (根据过滤压差Δp和流体通过滤饼的速度成正比 ) |
| 有： |
| Δp/l=(μαρ0)ν (3.25) |
| Where |
| l--- the thickness of the cake (式中l-滤饼的厚度 ) |
| μ--- the fluid velocity (u-料液的粘度) |
| α--- the specific resistance of the cake(a－滤饼的比阻力 ) |
| ρ0 --- the mass of solid per volume of liquid feed (ρ0－单位体积料液所含的滤渣量) |
| -dp/dr=(μαρ0)ν (3.26) |
| 2πrlυ=Q (3.27) |
| 由（3.26）和（3.27） |
| -dp/dr=μαρ0Q/(2πrl) (3.28) |
| 4、常见的离心过滤设备 |
| （a）三足式离心机 |
| 是最常见的过滤式离心机，立式有孔转鼓悬挂于三根支足上故而得名 |
| （b）卧式刮刀离心机 |
| 可连续生产，使用效率更高，功率消耗小 |
| （c）螺旋卸料离心机 |
| 主要用于需耐压的场合，具较高的分散因数 |
| 七、本章作业 |
| 1、何谓沉降 |
| 2、沉降与离心的异同 |
| 3、沉降与离心的速度方程 |
| 4、离心设备可分为哪两大类 |
| 5、常用的离心沉降设备有哪些 |
| 6、常用的离心过滤设备有哪些 |
|
| 第四讲 细胞破碎 2学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的内容 |
| 1、细胞破碎的意义 |
| 2、常用的细胞破碎方法 |
| 3、渗透压计算方法 |
| 4、了解机械破碎法所用设备 |
| 5、渗透压的计算 |
| 二、细胞破碎的目的 |
| In some cases, the products of interest are not in the broth but are in the biomass. In particular, most proteins produced in quantity by genetically manipulated bacteria are not excreted into the broth, but are precipitated within the cell. Lipids and some antibiotics are also trapped in the biomass. In a few cases, like baker’s yeast, the desired product is the cell mass itself. In a few others, desired products like steroids can be extracted without rupturing the cells. In many cases, the product is trapped in the biomass: It is intracellular. |
| Releasing this trapped material usually involves rupturing the cell wall, and is the subject of this short chapter. The methods of cell rupture have largely been developed in biochemistry, and hence are of small scale. Their application to the larger scale operations implied by genetic engineering is speculative. The equipment which is used is not designed for biotechnology. Some equipment is borrowed from the dairy industry, where it was developed for the homogenization of milk; other equipment is taken from the paint industry, where it is used for the size reduction of pigments. |
| 由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取 |
| 三、细胞膜 |
| At this point, we pause briefly to explore the physical structure of microbial membranes and the complexity of the problems which we face. At present, knowledge of this general structure does not provide a direct guide to methods of cell rupture. In the future, it may. As a result, we feel that a synopsis has merit. In this synopsis, we emphasize Gram-negative procaryotes. |
| 本节主要探寻细胞膜的物质结构及我们所面对的几个复杂问题。现在所有的关于细胞膜结构的基本知识，并不能为细胞破碎方法提供基本的引导。也许将来可以。正因如此，对此进行提纲切领的介绍很有必要。主要强调的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物 |
| 三、细胞破碎的主要方法 |
| 1、 化学法 |
| The chemical methods of cell rupture listed in Table 4.0-1 are dominated by osmotic shock, detergent so1ubilization, and lipid dissolution. These three methods are described in the following paragraphs. Before this description, we want to give some brief generalizations about the other two methods: enzyme digestion and alkali treatment. |
|
| 渗透冲击：无论动物还是植物细胞，胞内物质都是由膜组织包裹起来的，因此，破坏细胞膜系统是胞内物质释放的关键步骤 |
| 通常细胞膜系统强度较差，易受渗透压冲击而破碎 |
| The simplest of the three major chemical methods is osmotic shock. This is nothing more than dumping a given volume of cells into pure water- often about twice the volume of cells. The cells swell because they contain solutes which cause an osmotic flow of water into the cells. In some cases, they swell so much that they burst. Their contents, released into the surrounding solution, can now be separated using the methods in following chapters. |
| （最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物可用后面章节介绍的方法分离。） |
| 渗透压的计算方法 |
|
| 酶消化：酶法破坏细胞膜系统 |
| The disadvantage of enzyme digestion is the cost of the enzymes which. Frequently makes this method prohibitive at a large scale. This is unfortunate, because the method is both gentle and selective. It is nothing more than adding to a cell suspension enzymes which react quickly with the cell walls and destroy them. Because the enzymes selectively catalyze these cell wall reactions, they react only sparingly with other solutes within the cell |
| （酶消化法的缺点在于酶的消耗限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。） |
| 增溶：利用表面活性剂的增溶作用，将体积为细胞体积2倍的某浓度的表面活性剂溶液加入到细胞中去，表面活性剂能将细胞破碎，制成的悬浮液可通过离心分离除去细胞碎片 |
| The second major method of chemically rupturing cells is solubilization by detergents. Typically,a concentrated detergent solution is added to about half the solution’s volume of cells. The detergent disrupts the cell mem-brane. The resulting suspension can be centrifuged to remove cell frag-ments, and then run through an adsorption column or an extractor to isolate the product. |
| (最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表面活性剂加入到细胞中。表面活性剂能将细胞壁破碎，制成的悬浮液可用离心分离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。) |
|
| 脂溶：在细胞悬浮液中加入一定量的有机溶剂，细胞壁脂质层吸收后，导致胞壁膨胀，最后裂开，细胞质中的物质就释放到周围溶液中了 |
| 碱处理： |
| Alkali treatment is the antithesis of enzyme digestion, for it is harsh rather than gentle, nonselective rather than specific, and cheap rather than expensive. Alkali added to a cell suspension reacts with the cell walls in a number of ways, including the saponification of lipids in the cell walls. |
| (碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。 ) |
| 2、 械法 |
| 匀浆法 |
| 研磨法 |
| 超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行细胞破碎，效率更高 |
| 球磨破碎法 |
| 3、 其它破碎方法 |
| 冻结－融化法（亦称冻融法） |
| 干燥法 |
| 四、本章作业 |
| 1、简述细胞破碎的意义 |
| 2、细胞破碎方法的大致分类 |
| 3、渗透压的计算方法 |
|
| 第五讲 萃取 6学时 |
| 一、通过本章学习因掌握以下内容： |
| 1、 什么是萃取过程？ |
| 2、 萃取平衡的条件？ |
| 3、液－液萃取的分类？ |
| 4、常见物理萃取体系由那些构成要素？ |
| 5、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？ |
| 6、掌握多级萃取萃取级数的计算方法。 |
| 7、萃取设备的选择方法 |
| 8、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？ |
| 9、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？ |
| 10、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理 |
| 11、反应萃取的基本原理 |
| 二、萃取过程 |
| 利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的 |
| 物理萃取、化学萃取 |
| 三、物理萃取 |
| 利用溶剂对需分离组分有较高的溶解能力，分离过程纯属物理过程 |
| 溶质：被萃取的物质 |
| 原溶剂：原先溶解溶质的溶剂 |
| 萃取剂：加入的第三组分 |
| 萃取剂选择原则：使溶质在萃取相中有最大的溶解度 |
| 1、 分配系数：衡量萃取体系是否合理的重要参数-------- X/Y |
| 2、 萃取分离的基本方程 |
|
| 由物化理论可知：萃取操作达到平衡时，溶质在轻相和重相中的化学势相等。即 |
|
| 由上式可知，分配系数的对数值与标准状态下的化学势的差值有关 |
| 因此，要提高溶质的分配系数，必须提高标准状态下，其在重相与轻相的化学势之差。 |
| 可以采取的方法有： |
| （a）改变溶剂 |
| （b）改变溶质的特性 |
| l 生成有用离子对－－可溶于萃取剂的离子对 |
| 将强酸弱碱盐或强碱弱酸盐生成弱酸弱碱盐 |
| l 通过改变原溶剂中的pH值，改变溶质的解离 |
| 3、 单级萃取：使含溶质的溶液（h）和萃取剂（L）解出混合，静止后分成两层。 |
| 4、 多级萃取：是工业生产最常用的萃取流程 |
| 分离效率高 |
| 产品回收率高 |
| 溶剂用量少 |
| 5、 常用的萃取设备 |
| 混合－沉降器 |
| 旋转圆筒萃取塔 |
| 离心萃取器 |
| 填充塔 |
| 喷雾塔 |
| 旋转圆盘塔 |
| 四、超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction， SFE） |
| 1、超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。 |
| 特点： |
| （a）密度接近液体－－萃取能力强 |
| （b）粘度接近气体－－传质性能好 |
|
| 2、超临界流体萃取的基本思想 |
| 利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离 |
| 常用萃取剂： |
| （1）极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难） |
| （2）非极性萃取剂：二氧化碳（易） |
| 3、超临界二氧化碳萃取 |
| 临界点： |
| T：304.1 P：73.8 bar |
| 优点： 缺点： |
| 临界条件温和 设备投资大 |
| 产品分离简单 |
| 无毒、无害 |
| 不燃 |
| 无腐蚀性 |
| 价格便宜 |
|
| 超临界CO2萃取流程图 |
|
| 超临界流体的应用 |
| （1）咖啡因萃取 |
| （2）植物油：胚芽油、玉米油、γ亚麻酸 |
| （3）天然香料：杏仁油、柠檬油 |
| （4）啤酒花 |
| （5）尼古丁 |
| 五、双水相萃取（Aqueous Two Phase） |
| 1、概念：利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法 |
| 2、可以构成双水相的体系： |
| （1）离子型高聚物－非离子型高聚物 |
| PEG－DEXTRAN |
| （2）高聚物－相对低分子量化合物 |
| PEG－硫酸铵 |
| 3、双水相萃取的原理 |
| 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用： |
| （a）氢键 |
| （b）电荷力 |
| （c）疏水作用 |
| （d）范德华力 |
| （e）构象效应 |
| 4、双水相系统中目标物分配系数的影响因素 |
| （1）成相高聚物浓度－－界面张力 |
| （2）成相高聚物的相对分子量 |
| 一般来说，蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相 |
| （3）电化学分配 |
| 双水相萃取时，蛋白质的分配系数受离子强度的影响很小 |
| （4）疏水反应 |
| （5）生物亲和分配 |
| （6）温度及其它因素 |
| 5、双水相萃取的优点 |
| （1）平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化 |
| （2）操作简便 |
| （3）易于放大 |
| 六、反胶束萃取（Reversed Micelles Extraction） |
| 胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 |
| 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚集体 |
| 微团和反微团 |
| 1、微团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核” |
| 2、反微团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核” |
| 3、反微团的优点 |
| （1）极性“水核”具有较强的溶解能力。 |
| （2）生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。 |
| （3）由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。 |
| 因此，可作为酶固定化体系，用于水不溶性底物的生物催化 |
| 4、构成反胶团的表面活性剂种类 |
| （1）阴离子表面活性剂 |
| AOT |
| （2）阳离子表面活性剂 |
| 季铵盐 |
| 七、化学萃取 |
| 1、概念：利用可与被萃目标物发生反应的非极性物质作为萃取剂进行的反应 |
| 2、络合萃取分离有机酸（醋酸） |
| 季铵盐 |
| 叔胺 |
| 3、络合萃取体系构成 |
| 萃取剂 |
| 稀释剂 |
|
|
|
| 八、本章作业 |
| 1、什么是萃取过程？ |
| 2、液－液萃取从机理上分析可分为哪两类？ |
| 3、常见物理萃取体系由那些构成要素？ |
| 4、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？ |
| 5、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？ |
| 6、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？ |
| 7、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理 |
|
| 第六讲 吸附与离子交换 6学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的问题 |
| 1、什么是吸附过程？ |
| 2、吸附的类型有哪些？它们是如何划分的？ |
| 3、常用的吸附剂种类有哪些？ |
| 4、什么是吸附等温线？其意义何在？ |
| 5、影响吸附过程的因素有哪些？ |
| 6、什么是亲和吸附？其特点有哪些？ |
| 7、常用的吸附单元操作有哪些方式？ |
| 8、什么是离子交换？ |
| 9、离子交换树脂的分类？其主要的理化性质有哪些？ |
| 10、离子交换的机理是什么？ |
| 11、什么是离子交换的选择性？其选择性受哪些因素影响？ |
| 12、基本的离子交换操作是怎样的？ |
| 13、如何利用离子交换法分离蛋白质？ |
| 二、什么是吸附？（Adsorption） |
| 1、吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。 |
| 2、吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。 |
| 三、常见的吸附类型及其主要特点 |
| 1、物理吸附： 吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快。 |
| 2、化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。 |
| 四、常用吸附剂种类 |
| 吸附剂通常应具备以下特征：对被分离的物质具有较强的吸附能力、有较高的吸附选择性、机械强度高、再生容易、性能稳定、价格低廉。 |
| 1、活性炭：是非极性吸附剂，因此在水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能力 |
| 针对不同的物质，活性炭的吸附规律遵循以下规律： |
| （1）对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物 |
| （2）对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物; |
| （3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物; |
| （4）pH值的影响 碱性 中性吸附 酸性洗脱; |
| 酸性 中性吸附 碱性洗脱; |
| （5）温度 未平衡前 随温度升高而增加; |
| 2、大孔网状吸附剂 |
| 特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。 |
| 但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素的影响。 |
| 大孔网状吸附树脂的种类： |
| （1）非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，交联剂为二乙烯苯，又称芳香族吸附剂。 |
| （2）中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。 |
| （3）极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。 |
| 吸附机理： |
| 非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循以下规律： |
| （1）非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质； |
| （2）极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质； |
| （3）中等极性吸附剂兼有以上两种能力 |
| 四、吸附等温线 |
| 概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。 |
| Langmuir吸附等温线 |
|
| qo和K是经验常数，c代表溶液中溶质浓度 |
| 蛋白质分离提纯时适合此吸附方程 |
|
| 五、影响吸附的主要因素 |
| 1、吸附剂的性质：比表面积、粒度大小、极性… |
| 2、吸附质的性质：对表面张力的影响，溶解度，极性，相对分子量… |
| 3、温度：吸附是放热过程，吸附质的稳定性 |
| 4、溶液pH值：影响吸附质的解离 |
| 5、盐浓度：影响复杂，要视具体情况而定 |
| 六、亲和吸附 |
| 1、亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。 |
| 吸附剂由载体和配位体组成 |
| 2、亲和吸附的特点 |
| （a）效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。 |
| （b）分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物 |
| （c）但通用性较差，洗脱条件苛刻 |
| 3、影响亲和吸附的因素 |
| （1）配基浓度 配基浓度高有利； |
| （2）空间位阻 加入“手臂链”以降低空间位阻的影响； |
| （3）配基与载体的结合位点 就蛋白质等大分子作为配基时，与载体连接的键越少越好； |
| （4）载体孔径：孔道大小； |
| （5）微环境：载体或“手臂链”的极性、电性； |
| 七、离子交换(ion exchange) |
| 1、概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。 |
| 2、离子交换树脂的构成 |
| （1）具有三维空间离体结构的网络骨架 |
| （2）联接在骨架上的活性基团 |
| （3）活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子） |
| 3、离子交换的分类 |
| 按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。 |
| 具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴 |
| 4、常用的离子交换树脂 |
| （1）强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）； |
| （2）弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团； |
| （3）强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基； |
| （4）弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱； |
| 5、新型离子交换树脂 |
| （1）大孔离子交换树脂 |
| 大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂。 |
| （2）多糖基离子交换树脂 |
| 固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分子物致变性作用 |
| 主要的多糖基离子交换树脂 |
| （a）离子交换纤维素 |
| 树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类。 |
| 特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高 |
| 常用的离子交换纤维素有： |
| 甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素（CMC）、二乙基氨基乙基纤维素（DEAE） |
| （b）葡聚糖凝胶离子交换树脂 |
| 骨架为葡聚糖凝胶，如sepharose、sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂 |
| 命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号 |
| 特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率 |
| 常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂： |
| CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-25等 |
|
| 6、离子交换树脂的理化性能 |
| （1）外观：球形、浅色为宜，粒度大小为16~60目>90%； |
| （2）机械强度：>90%； |
| （3）含水量：0.3~0.7g/g 树脂； |
| （4）交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）； |
| （5）稳定性：化学稳定性、热稳定性； |
| （6）膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构； |
| （7）湿真密度：单位体积湿树脂的重量； |
| （8）孔度、孔径、比表面积 |
| 7、离子交换机理 |
|
| 8、影响交换速度的因素 |
| （1）颗粒大小：愈小越快 |
| （2）交联度：交联度小，交换速度快 |
| （3）温度：越高越快 |
| （4）离子化合价：化合价与高，交换越快 |
| （5）离子大小：越小越快 |
| （6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快 |
| （7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时， |
| 浓度越大，交换速度越快 |
| 9、离子交换的选择性 |
|
| 离子交换常数：交换势或交换系数 |
|
| 10、影响离子交换选择性的因素 |
| （1）水合离子半径：半径越小，亲和力越大； |
| （2）离子化合价：高价离子易于被吸附； |
| （3）溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量； |
| （4）离子强度：越低越好； |
| （5）有机溶剂：不利于吸附； |
| （6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； |
| （7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力； |
| 11、离子交换操作方法 |
| （1） 树脂预处理 |
| 物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒； |
| 化学处理：转型（氢型或钠型） |
| 阳离子树脂 酸—碱—酸 |
| 阴离子树脂 碱—酸—碱 |
| 最后以去离子水或缓冲液平衡 |
| （2） 离子交换吸附 |
| 静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全 |
| 动态：离子交换柱，操作连续、交换完全，适宜多组份分离 |
| 柱式固定床 |
| （3） 洗脱 |
| 离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法 |
| 洗脱方法 |
| （a）改变溶液pH值 |
| （b）改变溶液离子强度 |
| （4）再生 |
| 是指是离子交换树脂重新具有交换能力的过程 |
| 酸性阳离子树脂 酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗 |
| 碱性阴离子树脂 碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗 |
| 方式有：顺流再生和逆流再生 |
| 八、离子交换应用实例（离子交换法提取蛋白质） |
| 1、 蛋白质的结构特点 |
| （1） 多肽链 |
| （2） 电荷分布不均匀 |
| （3） 疏水性 |
| （4） 不同的蛋白质具有不同的表面电荷分布 |
| 2、 pH值对蛋白质荷电情况的影响 |
| 3、 蛋白质的滴定曲线 |
| 不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点（pI），当溶液（环境）pH值低于其pI时，蛋白质带正电荷，而当环境pH值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越多，其所带电荷越多； |
| 4、 缓冲液pH的选择 |
| 离子交换是依据不同蛋白质荷电性质以及大小差异进行分离的，因此缓冲液的选择将直接影响蛋白质的荷电情况，对于分离的选择性具有重要影响。 |
| 5、 离子交换分离蛋白质的基本步骤 |
| 蛋白质的离子交换分离同样要经过：平衡、吸附、洗脱和再生四个阶段，具体过程如下图所示： |
|
| 九、本章作业 |
| 1、P223 第一题，第二题 |
| 2、影响吸附的主要因素？ |
| 3、亲和吸附的原理和特点是什么？ |
| 4、常用的离子交换树脂类型有哪些？ |
| 5、影响离子交换速度的因素有哪些？ |
| 6、用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些哪些特殊要求，主要有哪几类？ |
|
| 第七讲 色谱技术 6学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的问题 |
| 1、什么是色谱分离技术？ |
| 2、色谱分离技术的分类？ |
| 3、什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？ |
| 4、什么是吸附色谱及其分类和基本原理？ |
| 5、什么是分配色谱？ |
| 6、离子交换色谱的分类及应用 |
| 7、凝胶色谱的分离原理及分类 |
| 8、离子交换及疏水作用层析的原理 |
| 9、高效液相色谱的分离原理及应用？ |
| 10、蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ |
| 二、什么是色谱技术（Chromatography） |
| 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 |
| 简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论 |
| 三、色谱分离方法的分类 |
| 色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种： |
| 1、吸附色谱 |
| 2、分配色谱 |
| 3、离子交换色谱 |
| 4、凝胶色谱 |
| 四、色谱分离的基本概念 |
|
| 1、分配系数：可由Langmuir方程得出 |
| Kd---分配系数 |
| q、c---溶质在固相和液相中的浓度 |
| 2、保留时间（tR）和保留体积（VR）：反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一 |
|
| 3、色谱柱的理论塔板数、塔板高度 |
| 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 |
| 理论塔板数的计算方法： |
|
| N---理论塔板数 tR---保留时间 |
| W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 |
| 理论塔板高度： |
|
| L---柱长 |
| 五、吸附色谱 |
| 1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离 |
| 2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择 |
| 3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 |
| 4、常用的吸附剂： |
| 氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土 |
| 5、展开剂的选择 |
| 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 |
| 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 |
| 展开剂选择的原则： |
| （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 |
| （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 |
| 6、吸附色谱的操作程序 |
| （1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 |
| （2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 |
| （3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 |
| 六、分配色谱 |
| 1、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 |
| 2、构成要素：固定相、载体、流动相 |
| 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 |
| 载体种类： |
| 硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶 |
| 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相 |
| 流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） |
| *反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的 |
| 3、HPLC（High Performance Liquid Chromatography） |
| 是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性HPLC） |
|
| 4、反相液相色谱 |
| 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 |
| 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm ） |
| Hypersil Spherosil XOB075 |
| 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 |
| C18适于分离核酸 |
| 苯基 |
| 流动相的选择 |
| 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 |
|
| 七、离子交换色谱 |
| 1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 |
| 2、常用的离子交换树脂 |
| （1）葡聚糖凝胶型 |
| DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 |
| （2）纤维素系列离子交换剂 |
| DEAE-Sephacel Cellex系列 |
| （3）琼脂糖系列离子交换剂 |
| Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow |
| Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 |
| （4）Source 系列离子交换剂 |
| 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 |
| 阳离子交换树脂 S系列 |
| 阴离子交换树脂 Q系列 |
| （5）MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） |
| 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 |
| 同样分为Q系列和P系列 |
| 八、分子筛凝胶色谱（Gel Penetration Chromatography, GPC） |
| 1、概念：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 |
| 2、特点： |
| 操作简便 |
| 分离效果好，重复性高，回收率高 |
| 分离条件温和 |
| 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 |
| 分辨率低 |
|
| 3、分子筛凝胶色谱原理 |
|
| 不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离（如上图所示） |
| 九、疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） |
| 1、 原理：依据生物大分子疏水性差异实现分离 |
| 由于不同蛋白质分子氨基酸组成差异，其疏水性也不尽相同，HIC技术是基于生物大分子的疏水性差异而实现分离的，该方法弥补了HPLC难以用于蛋白质等生物大分子的分离的不足。具体方法是： |
| 在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，固定相表面修饰了一些疏水的基团，这样蛋白质的疏水部分即可与固定相发生较强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面，而一旦降低流动相的盐浓度即可实现蛋白质的洗脱（见下图），方便易行，是蛋白质分离的常用手段之一。 |
|
| 十、亲和色谱（Affinity chromatography） |
| 所谓亲和色谱就是将亲和技术和色谱技术集成得到的一种高效分离手段，其原理与亲和吸附基本类似，所不同的是经过修饰的载体颗粒是填充在色谱柱中，以实现连续的色谱分离 |
| 载体活化、配基连接、吸附、洗脱 |
|
| 十一、蛋白质分离常用的色谱方法 |
| 1、免疫亲和层析 |
| 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离 |
| 免疫亲和层析介质的获得： |
| （1）获得抗体 |
| （2）抗体连接到载体上 |
| 2、疏水层析 |
| 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。 |
| 3、离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 |
| 操作要点： |
| 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定 |
| 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 |
| 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点） |
| 缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol |
| 层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整 |
| 洗脱方式：pH梯度 |
| 离子强度梯度 |
| 十二、本章作业 |
| 1、色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理 |
| 2、 何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？ |
| 3、 简述高效反相液相色谱的工作原理？ |
| 4、 试分析HPLC和HIC技术的异同 |
|
| 第八讲 沉析 3学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的问题 |
| 1、什么是沉析？ |
| 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ |
| 3、沉析的一般操作步骤是什么？ |
| 4、何谓盐析？其原理是什么？ |
| 5、盐析操作时常用的盐是什么？ |
| 6、影响盐析的主要因素有哪些？ |
| 7、有机溶剂沉析法的原理是什么？ |
| 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ |
| 9、等电点沉析的工作原理是什么？ |
| 10、其它常用的沉析方法有哪些？ |
| 二、何谓沉析？（Precipitation） |
| 利用沉析剂（precipitator）使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 |
| 三、沉析的特点 |
| 操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 |
| 四、分类 |
| 盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 |
| 五、沉析操作的一般过程 |
| 1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； |
| 2、沉淀物的陈化，促进晶体生长； |
| 3、离心或过滤，收集沉淀物； |
| 六、盐析(Salt induced precipitation) |
| 1、概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 |
| The most common type of precipitation for proteins is Salt induced precipitation. Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out. |
|
| 2、盐析原理 |
| 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： |
| （1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 |
| （2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 |
|
| 3、盐析过程 |
| 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： |
| （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 |
| （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： |
| （a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； |
| （b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； |
| 4、离子强度对盐析过程的影响 |
|
| Cohn经验公式 |
|
| S—蛋白质溶解度，mol/L; |
|
| I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 |
| β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； |
| Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 |
| Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； |
| β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； |
| 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 |
| 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 |
| 5、盐析用盐的选择 |
| 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： |
| 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 |
| （Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁 |
| 选用盐析用盐的几点考虑： |
| （1）盐析作用要强 |
| （2）盐析用盐需有较大的溶解度 |
| （3）盐析用盐必须是惰性的 |
| （4）来源丰富、经济 |
| 6、常用的盐析用盐 |
| #硫酸铵：溶解度大（767g/L） |
| 硫酸钠 |
| 磷酸盐 |
| 柠檬酸盐 |
| 7、影响盐析的因素 |
| （1）溶质种类的影响：Ks和β值 |
| （2）溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； |
| （3）蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； |
| （4）pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近； |
| （5）盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降； |
| 8、盐析用盐的用量选择 |
| 饱和度的概念： |
| 以硫酸铵为例： |
| 25oC时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度 |
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| 七、有机溶剂沉淀 |
| 1、概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 |
| 2原理： |
| （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 |
| （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 |
| 3、常用的有机溶剂沉析剂 |
| 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； |
| 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； |
| 特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 |
| 丙酮的介电常数是22 |
| 容易获取 |
| 4、有机溶剂沉析的特点 |
| （1）分辨率高； |
| （2）溶剂容易分离，并可回收使用； |
| （3）产品洁净； |
| （4）容易使蛋白质等生物大分子失活； |
| （5）应注意在低温下操作； |
| （6）成本高 |
| 5、溶剂选择 |
| （1）介电常数要小 |
| （2）致变性作用要小（甲醇） |
| （3）毒性要小、挥发性适中 |
| （4）水溶性要好 |
| 6、影响有机溶剂沉析的主要因素 |
| （1）温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； |
| （2）搅拌速度：散热 |
| （3）溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI） |
| （4）离子强度：离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L |
| （5）样品浓度：0.5~2% |
| 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 |
| 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 |
| （6）金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ |
| 八、等电点沉淀法 |
| 1、概念： |
| 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 |
| 2、原理： |
| 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 |
|
| 3、特点： |
| 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 |
| 操作时的注意事项： |
| （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 |
| （2）溶质的稳定性 |
| （3）盐析效应 |
| 九、其它沉淀法 |
| （1） 水溶性非离子型聚合物沉淀剂 |
| PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯 |
| 常用的此类沉淀剂是PEG，相对分子量一般为6000； |
| （2） 成盐类复合物沉析剂 |
| A. 金属复合盐：与生物分子的酸性基团作用，Cu2＋、Ag＋、Zn2＋ |
| B. 有机酸复合盐：与生物分子的碱性基团作用 |
| C. 无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐 |
| （3） 离子型表面活性剂 |
| CTAB（十六烷基三甲基季铵盐溴化物）、十二烷基磺酸钠（SDS） |
| （4） 离子型多聚物沉析剂 |
| 核酸（多聚阴离子）、鱼精蛋白（多聚阳离子） |
| （5） 氨基酸类沉析剂 |
| 一类选择性沉淀剂。如组氨酸－氯化汞，精氨酸－苯甲醛，亮氨酸－邻二甲基苯磺酸等 |
| （6） 分离核酸用沉析剂 |
| 酚、氯仿、SDS |
| （7） 分离粘多糖用沉析剂 |
| 乙醇、CTAB |
| （8）选择性变性沉析法 |
| 十、本章作业 |
| （1）常用的蛋白质沉淀方法有哪些？ |
| （2）影响盐析的主要因素有哪些？ |
| （3）何谓中性盐的饱和度？盐析操作中，中性盐的用量（40% 硫酸铵饱和度）如何计算？ |
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| 第九讲 电泳与膜分离 6学时 |
| 一、 通过本章学习应掌握的内容 |
| 1、 膜分离的概念 |
| 2、 膜的概念 |
| 3、 膜分离技术的分类 |
| 4、 基本的膜材料有哪些？ |
| 5、 常用的膜组件有哪些？ |
| 6、 何谓反渗透？实现反渗透分离的条件是什么？ |
| 7、 强制膜分离的概念？ |
| 8、 电渗析的工作原理？ |
| 9、 电泳的概念 |
| 10、 电泳的基本原理 |
| 11、 电泳技术的分类 |
| 12、 基本的电泳系统组成 |
| 13、 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理 |
| 14、 SDS PAGE的分离原理 |
| 15、 何谓等电聚焦？如何形成载体两性电解质pH梯度？ |
| 16、 何谓双相电泳？其作用是什么？ |
| 二、膜分离技术 |
| 1、 膜分离的概念 |
| 利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 |
| 2、 膜的概念 |
| （1）在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜。 |
| （2）膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成的复合体 |
| （3）被膜分开的流体相物质是液体或气体 |
| （4）膜的厚度应在0.5mm以下，否则不能称其为膜。 |
| 3、 膜分离技术的类型和定义 |
| 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类： |
| （1）微滤：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.025~14μm之间； |
| （2）超滤：分离介质同上，但孔径更小，为0.001~0.02 μm，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质； |
| （3）反渗透：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001~0.001 μm之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）； |
| （4）纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm； |
| （5）电渗析：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作； |
| 4、 膜的分类 |
| u按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜 |
| u按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜 |
| u按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料膜 |
| 5、 膜材料的特性 |
| 对于不同种类的膜都有一个基本要求： |
| （1）耐压：膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，一般模操作的压力范围在0.1~0.5Mpa，反渗透膜的压力更高，约为1~10MPa |
| （2）耐高温:高通量带来的温度升高和清洗的需要 |
| （3）耐酸碱：防止分离过程中，以及清洗过程中的水解； |
| （4）化学相容性：保持膜的稳定性； |
| （5）生物相容性：防止生物大分子的变性； |
| （6）成本低； |
| 6、 各种膜材料 |
| （1）有机高分子膜： |
| 纤维素酯膜、缩合系聚合物（聚砜类）、聚烯烃及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺类聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯； |
| （2）无机多孔膜：陶瓷膜 |
| 7、 膜组件 |
| （1）管式 |
| （2）中空纤维 |
| （3）螺旋卷绕式 |
| （4）平板式 |
| 共同的特点 |
| （1）尽可能大的膜表面积 |
| （2）可靠的支撑装置 |
| （3）可引出透过液 |
| （4）膜表面浓度差极化达到最小 |
| 8、超滤和反渗透 |
| 目的：将溶质通过一层具有选择性的薄膜，从溶液中分离出来 |
| 分离时的推动力都是压强，由于被分离物质的分子量和直径大小差别及膜孔结构不同，其采用的压强大小不同。 |
| 反渗透膜的操作压力高达10 MPa |
| 超滤和反渗透操作中的渗透压 |
| 由于超滤和反渗透过程都是用一种半透膜把两种不同浓度的溶液隔开（淡水或盐水），因此都存在渗透压。 |
| 渗透压的大小取决于溶液的种类、浓度和温度； |
| 一般说来，无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多。 |
| 9、渗透与反渗透 |
| 渗透是由于存在化学势存在梯度而引起的自发扩散现象。 |
| 溶液中水的化学势 |
|
| 因此，通常情况下， |
| 其结果是水从纯水一侧透过半透膜向溶液侧渗透，使后者的液位抬高。 |
| 如果在溶液一侧施加压力 |
| ，外界力做功使溶液中水的化学势升高，则纯水通过膜的渗透就会逐渐减小，并最终停止（条件？），此时的压力差就是溶液的渗透压 |
| 。 |
|
| 当 |
| 时，水将从溶液一侧向纯水一侧移动，此种渗透称之为反渗透。 |
| 10、实现超滤和反渗透的条件 |
| u超滤：需要增加流体的静压力，改变天然过程的方向，才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜，此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差； |
|
|
| u反渗透：过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压力比超滤大得多。 |
| u因此，超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程” |
| 11、超滤的基本方程 |
|
|
| 12、纳米膜过滤技术 |
| 介于反渗透与超滤膜之间，能截留有机小分子而使大部分无机盐通过； |
| 特点： |
| （1）在过滤分离过程中，能截留小分子有机物，并可以同时透析除盐，集浓缩与透析为一体； |
| （2）操作压力低 |
| 13、电渗析技术 |
| 电渗析技术是在直流电场的作用下，由于离子交换膜的阻隔作用，实现溶液的淡化和浓缩，分离推动力是静电引力。 |
|
| 三、电泳技术 |
| 1、电泳概念 |
| Arne Tiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者 |
| 定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动； |
| 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。 |
| 2、电泳的原理 |
| 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 |
| 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。 |
| 3、电泳迁移率 |
| 电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。 |
|
| 其单位是cm2·sec-1 ·V-1 |
| 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 |
| 4、电泳的大致分类 |
| 依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统 |
| （1）移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） |
| （2）区带电泳（zone electrophoresis ） |
| （3）稳态电泳（steady state electrophoresis ） |
| 其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。 |
| 5、区带电泳的主要技术 |
| 具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中的对流和扩散，可使被分离的成分得到最大分辨率的分离； |
| 区带电泳中的常用技术 |
| 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 |
| 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳 |
| 6、凝胶电泳 |
| 作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。 |
| 凝胶电泳的支持介质： |
| （1）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PGA） |
| 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成； |
| （2）琼脂糖凝胶： |
| 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的β-D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的； |
| 8、 丙烯酰胺的聚合 |
| 烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。 |
| 该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。 |
| 丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物； |
| 9、 影响聚合的主要因素 |
| （1）引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。 |
| （2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果； |
| （3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； |
| （4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 |
| （5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； |
| 10、聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 |
| 在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 |
| 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 |
| 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect） |
|
| 11、琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 |
| （1）琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。 |
| （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； |
| （3）无毒； |
| （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； |
| （5）热可逆性； |
| （6）生物中性：一般不与生物材料结合； |
| （7）电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益 |
| 12、电泳系统的基本组成 |
| （1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽 |
| （2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦3000~8000V |
| （3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； |
| （4）凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； |
| （5）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； |
| （6）电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜 |
| （7）电泳洗脱仪：回收样品 |
| （8）凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。 |
|
| 13、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| （1）原理 |
| 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。 |
| 因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。 |
| PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳 |
| （2）电泳前的准备工作 |
| 缓冲系统的选择： |
| （a）保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持； |
| （b）电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在3~10之间。 |
| 缓冲系统的选择原则是两种标准的对立权衡 |
| （a）如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄； |
| （b）如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高； |
| 因此，常常选择pH 8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5），Tris-硼酸(pH 8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH 7.2~8.5） |
| 凝胶浓度的选择 |
| 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。 |
| 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为： |
| （a）非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0%的琼脂糖凝胶； |
| （b）排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE |
| 凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； |
| 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离； |
| PAGE的具体操作过程 |
| 制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶； |
| 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）； |
| 电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部； |
| 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）； |
| 照相、凝胶干燥； |
| 定量测定； |
| 14、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定； |
| 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。 |
| （1）SDS-PAGE 的原理 |
| 蛋白质分子的解聚 |
| SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 |
| 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 |
| （2）未知蛋白质分子量的测定 |
| 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定； |
| 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量； |
| 15、载体两性电解质pH梯度等电聚焦 |
| 等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF |
| 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 |
| 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。 |
| 根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。 |
| （1）工作原理 |
| 蛋白质的等电点 |
| 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectric point pI）。 |
| 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。 |
| 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析 |
| （2）载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理 |
| 载体两性电解质pH梯度等电聚焦就是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。 |
| 载体两性电解质和pH梯度的形成 |
| 等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 |
| 载体两性电解质的概念： |
| 作为载体两性电解质应该具有以下特点： |
| （a）应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置； |
| （b）应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。 |
| 用于等电聚焦的主要载体两性电解质 |
| Ampholine(瑞典LKB公司) |
| 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比 |
| pH梯度的形成 |
| 在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。 |
| 当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。 |
| 其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。 |
| 水平等电聚焦电泳 |
| 制胶：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶； |
| 电泳：加样可在凝胶上的任何位置，浓度一般为0.5~2mg/ml； |
| 固定： |
| 染色： |
| 脱色： |
| （3）等电聚焦的主要应用 |
| 同工酶分离、分析 |
| pI 测定 |
| 16、双相电泳 |
| 第一相 等电聚焦 |
| 第二相 SDS－PAGE |
| 目的：为了获得更详细的组分信息。目前已经广泛应用于蛋白质组研究中 |
|
| 四、本章作业 |
| 1、 何谓膜分离？ |
| 2、 膜分离的种类 |
| 3、 何谓反渗透？ |
| 4、 常用的膜分离组件有哪些？ |
| 5、 何谓电泳？ |
| 6、 常规PAGE和SDS PAGE电泳有何异同？ |
| 7、 何谓双相电泳？ |
|
| 第十讲 结晶 3学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的内容 |
| （1）什么是结晶过程？ |
| （2）结晶操作的特点有哪些？ |
| （3）凯尔文公式的内容？ |
| （4）了解饱和温度曲线和过饱和温度曲线的内容？ |
| （5）在何种条件下，溶液中才有晶体析出？ |
| （6）影响晶体形成的主要因素有哪些？ |
| （7）晶种的作用是什么？ |
| （8）过饱和溶液形成的方法有哪些？ |
| （9）何为晶体生长的扩散学说？其具体意义何在？ |
| （10）常用的工业起晶方法有哪些？ |
| （11）晶体纯度的计算方法？ |
| （12）影响晶体质量的因素有哪些？ |
| （13）何为重结晶？ |
| 二、结晶的概念（Crystalization） |
| 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列 |
|
| 固体有结晶和无定形两种状态 |
| 结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则 |
| 无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则 |
| 三、结晶操作的特点 |
| （1）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。 |
| （2）通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。 |
| （3）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。 |
| 四、结晶过程分析 |
| 饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液； |
| 过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液； |
| 溶质只有在过饱和溶液中才能析出； |
| 溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有关。 |
| 五、凯尔文（Kelvin）公式 |
|
|
| 六、结晶过程的实质 |
| （1）结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。 |
| （2）这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中，这一过程与表面分子化学键力变化有关； |
| 因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。 |
| 七、晶体的形成 |
| 形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。 |
| 首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在 |
| 八、结晶的步骤 |
| （1）过饱和溶液的形成 |
| （2）晶核的形成 |
| （2）晶体生长 |
| 其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。 |
| 九、温度与溶解度的关系 |
| 由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与能量的传递过程，它与体系温度的关系十分密切。 |
| 溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过饱和曲线表示 |
| 在温度-溶解度关系图中，SS曲线下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的； |
| 而在SS曲线和TT曲线之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定； |
| 加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至SS线； |
| 介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区和养晶区。 |
| 在TT曲线的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至SS线（饱和）； |
| 晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，晶体质量差； |
| 因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。 |
| 十、过饱和溶液的形成 |
| （1）热饱和溶液冷却（等溶剂结晶） |
| 适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中； |
| （2）部分溶剂蒸发法（等温结晶法） |
| 适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系； |
| （3）真空蒸发冷却法 |
| 使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。 |
| （4）化学反应结晶 |
| 加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出； |
| 十一、晶核的形成 |
| 晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面； |
| 结晶过程中，体系总的自由能变化分为两部分，即：表面过剩吉布斯自由能（ΔGs）和体积过剩吉布斯自由能（ΔGv） |
| 晶核的形成必须满足： |
| ΔG= ΔGs+ ΔGv<0 |
| 通常ΔGs>0，阻碍晶核形成； ΔGv<0 |
| 十二、成核速度 |
| 由Arrhenius公式可近似得到成核速度公式： |
| B = ke-∆Gmax/RT |
| B——成核速度 |
| ∆Gmax——成核时临界吉布斯自由能，是成核时必须逾越的能阈 |
| k——常数 |
| 而∆Gmax可由下式表示： |
| 十三、常用的工业起晶方法 |
| （1）自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。 |
| （2）刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。 |
| （3）晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。 |
| 十四、晶体的生长 |
| 在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为晶体生长。 |
| 晶体生长的扩散学说： |
| 根据晶体扩散学说，晶体的生长由三个步骤组成： |
| （1） 结晶溶质借扩散作用穿过靠近晶体表面的一个滞流层，从溶液中转移到晶体的表面； |
| 扩散过程的速度是取决于液相主体浓度与晶体表面浓度之差； |
| kd——扩散传质系数 |
| A——晶体表面积 |
| C——液相主体浓度 |
| Ci——溶液界面浓度 |
| （2） 到达晶体表面的溶质长入晶面，同时放出结晶热； |
| 这是一个表面反应过程，其速度取决于晶体表面浓度与饱和浓度之差； |
| kr——表面反应速率常数 |
| A——晶体表面积 |
| C×——溶液饱和浓度 |
| Ci——溶液界面浓度 |
| 联立上述二式可得下式： |
| ，其中 |
| 为总的传质推动力，即过饱和度； |
| 为总传质系数 |
| 则有： |
| （3） 放出的结晶热传递回到溶液中 |
| 十五、影响晶体生长速度的因素 |
| （1）杂质：改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂质吸附导致的晶体生长缓慢； |
| （2）搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成； |
| （3）温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶速度； |
| 十六、提高晶体质量的方法 |
| （1）晶体质量包括三个方面的内容： |
| 晶体大小 |
| 形状 |
| 纯度 |
| （2）影响晶体大小的因素： |
| 温度、晶核质量、搅拌等 |
| （3）影响晶体形状的因素： |
| 改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质 |
| （4）影响晶体纯度的因素： |
| 母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布 |
| 十七、重结晶 |
| 经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有一定量的杂质。此时工业上常常需要采用重结晶的方式进行精制。 |
| 重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。 |
| 重结晶的操作过程 |
| （1）选择合适的溶剂； |
| （2）将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解； |
| （3）冷却使之再次结晶； |
| （4）分离母液； |
| （5）洗涤； |
| 十八、本章作业 |
| 1、结晶操作的原理是什么？ |
| 2、绘制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。 |
|
| 第十讲 结晶 3学时 |
| 一、通过本章学习应掌握的内容 |
| （1）什么是结晶过程？ |
| （2）结晶操作的特点有哪些？ |
| （3）凯尔文公式的内容？ |
| （4）了解饱和温度曲线和过饱和温度曲线的内容？ |
| （5）在何种条件下，溶液中才有晶体析出？ |
| （6）影响晶体形成的主要因素有哪些？ |
| （7）晶种的作用是什么？ |
| （8）过饱和溶液形成的方法有哪些？ |
| （9）何为晶体生长的扩散学说？其具体意义何在？ |
| （10）常用的工业起晶方法有哪些？ |
| （11）晶体纯度的计算方法？ |
| （12）影响晶体质量的因素有哪些？ |
| （13）何为重结晶？ |
| 二、结晶的概念（Crystalization） |
| 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列 |
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| 固体有结晶和无定形两种状态 |
| 结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则 |
| 无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则 |
| 三、结晶操作的特点 |
| （1）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。 |
| （2）通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。 |
| （3）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。 |
| 四、结晶过程分析 |
| 饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液； |
| 过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液； |
| 溶质只有在过饱和溶液中才能析出； |
| 溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有关。 |
| 五、凯尔文（Kelvin）公式 |
| [table] |
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