关于Western blot的灰度分析？

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1.对于Western blot目的蛋白条带的灰度分析有哪些好用的软件？
2.如果只保存了16bit的图，哪些软件可以识别？
3.在ImageJ中做灰度分析的具体步骤是怎样的？(感觉自己在各网站找到的教程和自己安装的ImageJ界面不太一样，部分功能也有差别)
谢谢！
原文地址：https://www.zhihu.com/question/268542930

感恩由您

Western blot是显示蛋白丰度相对变化的半定量方法，通过分析信号强度，可以确定样本中目标蛋白的表达量相对于其它样本（如对照组、模型组）是增加还是减少。将目标蛋白条带发出的信号使用软件进行分析，计算出目标蛋白的相对定量值，即为WB定量。
对WB条带进行定量有两种方法——灰度分析和光密度分析。今天分享用Image J 定量分析 WB 灰度值（附完整操作步骤截图）
<hr/>

Image J 安装可以戳之前发过的这篇文章↓↓↓

赛尔普生物：ImageJ？Fiji？Image pro plus？图像处理哪家强？<hr/>WB灰度分析（Band density）

灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。
Image J 分析灰度值操作步骤

打开Image J 软件，菜单栏选择File→Open（或使用快捷键Ctrl+O）→ 弹出对话框→选择目标文件夹→文件夹内找到WB条带图。



菜单栏选择Image→Type→8-bit，转化灰度图。


Process→Subtract Background，去除背景影响。


Rolling ball radius默认是50，在Light background选项进行勾选。


菜单栏选择Analyze→Set Measurements，在这里设置测量参数。


将需要分析的结果项勾选上，点击OK。

• Area（区域）
  
• Mean gray value（平均灰度值）
  
• Min & max gray value（最小和最大灰度值）
  
• Integrated density（集成密度）
  

菜单栏选择Analyze→Set Scale，设置单位。


Unit of length→【Pixels】，长度单位选择像素，之后点击OK。


菜单栏选择Edit → Invert，转换亮度，转为亮带。


在如下图所示的工具栏，选择区域选择工具，选中分析的单个条带。


菜单栏选择Anlyze→Measure，开始逐个分析。


所有结果分析如下图所示。
当测定完所有条带后，点击Results—File—Save as，导出Excel表格；也可选择Result中的“Edit”中的“Select All”,复制数据“IntDen”到Excel表格中进行分析。


对应研究基因和内参的IntDen，以研究基因/内参基因。在Excel表格中将目的蛋白灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。


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检验医师

常用的蛋白灰度分析软件有 Image-Pro Plus ，Quantity One ，Image J/fiji。（还有不太常用的还有Gel-Pro Analyzer、Image Lab等），所有的蛋白灰度分析软件可以在本文的第四部分下载。
不同软件测量值不同，即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可。不同的软件各有千秋，大家可以综合考虑再做选择。

工具下载：顶级图像分析工具，ImageJ、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定全部！
在下载的安装包内，除了ImageJ、Fiji、Image pro plus，另外还补充了Gel-Pro analyzer、quantity one、image lab安装包以及安装教程，有需要可以下载！

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一、常用的蛋白灰度分析工具对比

1、Image-Pro Plus
与我们耳熟能详的image J不同，image-Pro plus是一个付费使用的软件。
Image-Pro Plus 综合性能最好，操作简便结果可靠。因为它有强大的 IOD 算法，能准确反应蛋白灰度。但需要靠魔棒或轨迹法选取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本身就是半定量分析（也就是说测量值本身就没有一定标准）。
剔除背景调整参数之后，有 2 种方法选择目的蛋白区域：魔棒和手绘轨迹法
①魔棒：首选方法，客观科学，适合于蛋白条带轮廓清楚且各蛋白条带不融合（若条带弥散，相互融合，则魔棒无法选择单一蛋白条带，这时就要用手绘通过肉眼选择目的蛋白区域）。
②手绘轨迹法：主观性较强，当魔棒无法选择单一条带时才使用。




2、Quantity One
Biorad公司的Quantiy One软件，付费软件。其最大的优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它的很多功能渗透了艰深的数理理论以及概率统计的原理。
有泳道-轨迹测定法，等高线/手绘选取目的区域测定法等方法。
①泳道-轨迹测定法：先剔除一系列背景，再选择泳道（lane），然后分析条带（band），最后使用高斯建模得出灰度分析值（Gauss Model trace）。它最大优点在于可以完全抛弃人为主观因素进行全自动定量，比较科学。重复性好，但这种方法使用起来步骤较为繁琐。
②等高线-手绘选取目的区域测定法：通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这个方法最简便，但重复性不太好，且等高线的绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边缘。




3、Image J & fiji（ fiji is just ImageJ）
Image J 这款工具胜在免费，基于强大的图片分析与处理功能，Image J在科研中的应用极为广泛。（使用广泛也就意味着很多人都在用，遇到问题可以更快的找到解答）
Image J做蛋白灰度分析的步骤操作简单，容易上手。先转化灰度图以及去除背景影响，然后设置参数与单位，转化为亮带之后，利用选择工具选中分析的单个条带分析，之后逐一选取分析即可。
之前分享过详细的操作步骤，需要学习的可以看以下文章：
Image J 定量分析 WB 灰度值 (qq.com)


fiji 是 ImageJ 的版本之一，全称为 fiji is just ImageJ，也是免费工具。fiji 就是预装了很多生物医学分析常用插件的ImageJ。
Fiji 做蛋白灰度分析的步骤和Image J 一致，这里不再赘述。



二、关于蛋白灰度分析的相关知识点

Western blot是显示蛋白丰度相对变化的半定量方法，通过分析信号强度，可以确定样本中目标蛋白的表达量相对于其它样本（如对照组、模型组）是增加还是减少。将目标蛋白条带发出的信号使用软件进行分析，计算出目标蛋白的相对定量值，即为WB定量。
对WB条带进行定量方法之一是灰度分析，灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。
1、光密度与灰度
光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与染色物质的量相关的。
灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子照片上像素的亮度称为灰度。灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。
2、关于OD值
OD值是一个没有单位的相对值。使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。 对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。
电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。
3、吸光物质的光学密度
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。

三、WB灰度分析步骤

Image J定量分析WB灰度值
16bit的意思是说，能够显示出来的颜色的数量有16位数。8、24都是一样的。
一般灰度分析的要求图片8bit就好，image J可以直接将图片转化为8bit。
打开Image J 软件，菜单栏选择File→Open（或使用快捷键Ctrl+O）→ 弹出对话框→选择目标文件夹→文件夹内找到WB条带图。


菜单栏选择Image→Type→8-bit，转化灰度图。



Process→Subtract Background，去除背景影响。


Rolling ball radius默认是50，在Light background选项进行勾选。


菜单栏选择Analyze→Set Measurements，在这里设置测量参数。


将需要分析的结果项勾选上，点击OK。
Area（区域）
Mean gray value（平均灰度值）
Min & max gray value（最小和最大灰度值）
Integrated density（集成密度）


菜单栏选择Analyze→Set Scale，设置单位


Unit of length→【Pixels】，长度单位选择像素，之后点击OK。



菜单栏选择Edit → Invert，转换亮度，转为亮带。


在如下图所示的工具栏，选择区域选择工具，选中分析的单个条带。



菜单栏选择Anlyze→Measure，开始逐个分析。


所有结果分析如下图所示。
当测定完所有条带后，点击Results—File—Save as，导出Excel表格；也可选择Result中的“Edit”中的“Select All”,复制数据“IntDen”到Excel表格中进行分析；


对应研究基因和内参的IntDen，以研究基因/内参基因。在Excel表格中将目的蛋白灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。



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队长是我

蛋白免疫印迹实验常见问题原因分析汇总如下：
一、检测无信号
主要可能由于以下原因导致：
1. 用于检测的二抗不匹配。解决办法：需要确定一抗的宿主。
2. 一抗二抗的浓度过低：需要耐心地重新实验。
3.一抗不识别被检测物种中的蛋白质：可以再检查以下一抗的特异性。
4.凝胶上上样的蛋白量太少：凝胶上样品过少也会导致信号弱，所以适当增加样本量也可以防止此现象发生。
5.传输效率相当低：出现这种情况可以尝试修改转移程序的操作，确保 PVDF 与甲醇预孵育。转移后干燥 PVDF 以确保蛋白质与疏水膜的结合。
6.一抗使用次数过多：亿康如果过度稀释对信号检测也会有一定的影响，所以尽量使用新稀释的一抗。
7.阻塞时间过长或洗涤次数过多：尽量减少阻塞时间和洗涤时间。
8. 检测试剂盒不起作用：这种情况出现的较少，实验中注意试剂盒的有效期是否正常，也可使用阳性对照并确保检测试剂盒正常工作。
9.叠氮化钠可能会抑制二抗：尽量避免在稀释缓冲液中使用叠氮化钠。
10.一抗或二抗的孵育时间太短：可适当延长孵化时间
11. SDS 上样缓冲液和样品裂解液没有充分混合或者混合不均匀： SDS 上样缓冲液需要随用随配，以保证其新鲜度，另外缓冲液与裂解液可以使用涡旋混合器进行充分混合。




蛋白免疫


二、无蛋白质的区域具有高背景
蛋白免疫印迹常见问题中出现这种现象，可能由于以下几种情况所导致。
1.可能由于封闭时间过短或封闭缓冲液使用不当。大多数一抗基本不会和白蛋白或酪蛋白发生交叉反应。如果任何没有蛋白质的区域具有高背景，则封闭步骤可能无法正常工作。
2.一抗或二抗的浓度过高所致：适当降低抗体浓度。
3.洗涤不够充分：可以增加洗涤的次数。
4.孵化温度过高：一抗的孵育温度以4°C左右为宜。
5.转印膜选用不当，或者转印膜干燥：一般情况下选用PVDF膜具有较好的转印效果，同时防止膜干燥。
6.较高分子量的高背景也有可能是由于还原试剂、SDS或样品加热方式时长不正确。




实验室耗材,elisa试剂盒,PCR相关耗材,实验室耗材供应商-阿尔法
三、出现白带或信号迅速减弱
1.一抗或二抗过高：适当降低抗体浓度
2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鲜程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。
3.混合后的 ECL 溶液寿命缩短：注意选择合适的ECL 解决方案。
四、断带、特殊条带出现
凝胶电泳期间使用的电压过高或缓冲液温度过高会出现这种情况。
五、出现漫反射带
1.抗体浓度过高：适当降低抗体浓度。
2.凝胶上上样的蛋白质量太高：尽量减少上样量。




蛋白定量


六、出现空白区域
这种情况多数是由于转移不均匀所造成。转移时需要确保膜在凝胶上均匀无气泡。
七、非特异性信号
有的时候高浓度的抗体也导致非特异性信号出现。内源性免疫球蛋白，尤其是在组织裂解物中 容易出现信号干扰。可以通过预先清除内源性免疫球蛋白来减少来自内源性免疫球蛋白的非特异性信号。
八、条带模糊或者出现污斑
这多数由于凝胶平衡时间不足或凝胶与膜接触不均匀所致。

清风寡欲

WB检测：检测某种蛋白的有无及含量差异，与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
     样本检测前的准备：
组织样本：
     1）无论是动物组织还是植物组织都不要用锡箔纸或自封袋包裹，请选择EP管或标本管装 。
     2）组织取样时洗净血污，液氮或干冰速冻-80℃保存，保存时间3个月内为宜，时间过长蛋白可能降解。
     3）标本量100mg（黄豆大小）以上。骨头、脂肪蛋白含量较少组织需提供200-300mg。
     运输条件：干冰运输。
细胞样本：
     1）活细胞汇合度70%-80%，装满新鲜培养基，不透气培养瓶，封口膜封口常温运输；
     2）细胞沉淀；干冰运输。
     3）细胞上清，干冰运输。
     蛋白样本：
     1）加loading buffer变性。干冰运输。
血液样本：
     1）新鲜抗凝血，避免剧烈震荡，避免凝血；4℃运输；
     2）分离白细胞沉淀或提取白细胞蛋白。干冰运输。
非常规样本：
     1）菌液、材料蛋白、外泌体、精液、卵母细胞等保证蛋白含量充足。干冰运输。
其他特殊要求： 如客户提供试剂盒，要求提取特殊蛋白，需要提前和实验室沟通，并且准备好实验样本，保证样本量充足。按试剂盒要求运输。
WB（Western Blot）实验步骤
试剂准备
1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮蓝 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。
      样品制备
1、单层贴壁细胞总蛋白的提取：
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中（整个操作尽量在冰上进行）。
（6）于4℃下12000rpm离心5min（提前开离心机预冷）。
（7）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。
2、组织中总蛋白的提取：
（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
（1）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
（2）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
      含量测定
1、制作标准曲线
（1 ）从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2） 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。
（3 ）按下表在各管中加入各种试剂。
0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/ml BSA－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/L NaCl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml
（4）混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
2、检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
（2 ）取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100ul，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3 ）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用无菌水洗一次。
（4） 取一管考马斯亮蓝加95ul 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ul待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ul样品含的蛋白量。
SDS－PAGE电泳
1、清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2、灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。
（2） 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（3 ）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4 ）按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5 ）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
（6） 测完蛋白含量后，计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品）。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3、电泳
电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
1、转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的NC膜或PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的NC膜或PVDF膜置于水上浸2h才可使用。用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
2、将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
3、要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）。
4、将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰，或将转移槽埋于冰水混合物中来降温。一般用80V转移1h，或60V转移2h，或40V转移3h。
5、转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
半干转印仪
免疫反应
1、将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2、将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
3、同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，重复步骤（2）中最后一步，进行化学发光反应。
      化学发光
1、将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
2、在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
      凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
努力工作~  努力搬砖~ 感谢您的观看~实验过程中有问题请私信我~

大力水手

• QuantityOne，Bandscan，Gel-ProAnalyzer，TanonImage等成像系统专用软件都可以用作灰度分析。除了这些软件，用的最多的就是综合性质图像处理软件ImageJ。
  
• 16bit的意思是说，能够显示出来的颜色的数量有16位数。8、24都是一样的。一般灰度分析的要求图片8bit就好，image J可以调整。
  
• image J灰度分析步骤：
  

• 打开Image J软件，导入WB条带图片：File→Open→找到WB条带。
  
• 把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。
  

• 第一个矩形工具→选上所有条带→analyze→Gels→select first lane
  

• analyze→Gels→plot lanes（也可以分开选取，如：框选第一个条带→analyze→Gels→select first lane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select next lane），出现山峰样图。
  

• 选中直线工具，将开口波峰关闭
  

• 选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。
  

• 最后在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。在GraphpadPrism软件中作柱状图即可。
  

其实得出的area和Intden严格来说不是灰度值，而是面积，但用来量化WB条带是OK的。还有一种计算Intden的办法，是光密度值，也可以用来量化WB条带。
<hr/>知乎专属福利；助大家一臂之力、我为大家准备了一份基础实验protocol,细胞侵袭、细胞凋亡、细胞黏着、细胞周期等，不仅有细胞培养相关实验，还有包括不同研究水平实验技术Protocol，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作、IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等相关实验的详细步骤，全都是经过前辈们无数次验证过的，希望对大家的实验有帮助。
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