流式细胞术的基本原理、实验流程及结果分析 | 流式专栏（一）

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流式细胞术（Flow Cytometry, FCM），是通过检测悬液中的单个细胞或其他生物粒子上所标记的荧光信号，来对单个细胞或生物粒子进行定量分析和分选的一种技术。其概念首次在1934年由Moldavan提出[1]，但是将这个想法第一次运用于实际的是Gucker，他在1947年《Journal of American Chemical Society》上发表了一篇文章，介绍了一种通过测量化学颗粒和细菌孢子引起的光散射信号来检测化学战和生物战中烟雾气溶胶数量的装置，这是发明流式细胞仪的灵感来源[2]。
发展至今，流式细胞术已成为现代生物医学研究中不可或缺的工具，也是咱们免疫相关科研工作者需要掌握的一门重要技能。

为协助大家快速上手流式细胞术，小P特别邀请咱们流式部门研发人员，开展【流式专栏】，将通过多期文章给大家详细介绍流式细胞术的相关知识。本期为第一期，将介绍流式细胞术的基本原理、实验流程以及结果分析三大部分。

基本原理

流式细胞术的基本原理其实就是流式细胞仪的工作原理，我们首先需要了解流式细胞仪的基本构造。传统的流式细胞仪主要由三部分组成：液流系统、光学系统和数据处理系统（图1）[3]。
液流系统由流动室、样品管、鞘液管和喷嘴组成。样品在进入流动室之前，其中的细胞或微粒都是以随机的方式移动。在进入流动室之后，样品在液流压力的作用下从样品管中喷出，同时鞘液(通常为缓冲盐溶液)在高压下由鞘液管喷出，并包裹在样品流四周，形成稳定的同轴流动状态，然后从喷嘴喷出。样品流中的细胞或微粒在鞘液的作用下，会以相同的速度逐一通过激光检测点。



图1 流式细胞仪内部示意图[3]

光学系统由激发光源、分光镜和滤光片以及产生光电流的检测系统组成（图2）。经荧光染色的细胞或微粒受到合适的光激发后会产生许多不同波长的荧光信号，通过分光镜和滤光片可以将这些荧光信号区分开来并由不同的通道接收。之后光信号通过光电倍增管（Photomultiplier tube，PMT）转化为电信号，传输到数据处理系统。
流式细胞仪中常见的几种激光器主要有405nm（紫色）、561nm（黄色）、638nm（红色）和488nm（蓝色）等，不同的荧光染料可被相应的激光器激发，发出特定波长的光，从而被检测器检测。分光镜和滤光片的作用是引导光路到指定的检测通道，它通常由平面玻璃或棱镜制成，通过精密的设计，将入射的激光束按照特定的角度和波长进行分散和反射，使得不同波长的光聚焦于不同的位置上。



图2 流式细胞仪光学系统示意图（源于Proteintech）

滤光片主要分为长通滤光片（Long-pass filter，LP）、短通滤光片（Short-pass filter，SP）和带通滤光片（Band-pass filter，BP）。
长通滤光片是允许特定波长以上的光通过，以下的光不能通过，如LP500允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光则被反射回；短通滤光片是与长通滤光片相反，能使特定波长以下的光通过，以上的光不能通过，如SP500允许500nm以下的光通过，而500nm以上的光则被反射回；带通滤光片允许一个固定范围内波长的光通过，如BP520/20仅允许波长510nm-530nm范围的光通过。
近几十年来流式细胞术发展迅速，也出现了光谱流式和质谱流式等新技术，可以解决荧光基团数量有限和荧光补偿造成的多参数分析困难的问题，但是由于仪器和耗材造价较高，现在还是以传统的流式细胞仪为主。

实验流程

1. 方案设计

① 了解所研究细胞的基本特性，包括细胞的大小、相关的特异性标志物以及标志物在细胞上的表达丰度和定位。
② 了解实验室流式细胞仪的配置，选择合适的荧光偶联抗体。
③ 配色问题：一般在多色流式中需要考虑。低丰度或难以检测的标志物应该与荧光信号强的染料配对，高丰度的标志物与中等或荧光信号弱的染料配对；然后尽量避开有相关性的标志物使用通道之间有荧光溢漏的抗体来标记。
④ 实验对照：荧光补偿对照和荧光减一对照主要运用于多色流式中（具体在后续推文中解释）。一般只需要设置同型对照（Isotype Control）即可。在这里简单解释一下原理：
首先我们需要了解抗体的结构，抗体由两个抗原结合片段（Fragment of antigen binding，Fab）和一个可结晶段（Fragment crystallizable，Fc）组成，Fab是与细胞上抗原特异性结合的片段，Fc可与细胞表面Fc受体结合从而介导一系列免疫反应（图3a）[3]。当荧光偶联抗体没有与细胞上特异性抗原结合而是与Fc受体结合时就是一种非特异性染色（图3c）。因此在流式抗体染色前，我们一方面需要使用Fc block抗体将细胞表面的Fc受体进行封闭；另一方面还需要设置同型对照抗体为阴性对照，其是与靶点蛋白的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量，但对目标靶点无特异性结合的抗体（图3f），进一步扣除非特异性染色对实验的影响。



图3 荧光偶联抗体染色示意图[3]

2. 实验步骤

由于篇幅有限，关于胞内流式，多色流式等特殊流式实验的流程在这里不作详述，在后面的推文中会一一给大家讲解。下面以小鼠脾脏细胞表面流式染色为例进行简单的说明：
整个实验过程都需要在冰上且避光进行，能较好的保证细胞活性和防止荧光偶联抗体上的荧光淬灭，使我们的实验结果更可靠。
① 取出小鼠脾脏，放置到200目滤网上，用预冷的1×PBS缓冲液研磨，收集细胞悬液，2000rpm离心5min；
② 弃掉上清，加入4mL 1×红细胞裂解液（货号：PF00015），移液器吹打混匀，室温反应5min；
③ 用1×PBS缓冲液终止裂红，2000rpm离心5min；
④ 弃掉上清，加入预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞沉淀，2000rpm离心5min；
⑤ 弃掉上清，加入预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞沉淀，用200目的滤网进行过滤，计数，将细胞浓度调整至1×107/mL，之后按照100μL/test分装到2mL离心管中；
⑥ 每管加入死活细胞染料（Phantom Dye Red 780，货号：PD00002或Phantom Dye Violet 510，货号：PD00005）混匀，4℃孵育30min；
⑦ 每管加入2mL 预冷的1×PBS缓冲液，2000rpm离心5min；
⑧ 弃掉上清，加入预冷的100μL 1×PBS缓冲液，重悬细胞沉淀，再加入Fc block抗体（货号：65057-1-Ig），混匀，室温孵育10min；
⑨ 将相应的流式抗体和同型对照抗体按照合适的浓度分别加入到对应的离心管中，混匀，4℃孵育40min；
⑩ 每管加入预冷的2mL 1×PBS缓冲液，2000rpm离心5min；
⑪ 弃掉上清，每管加入预冷的200μL 1×PBS缓冲液，重悬细胞沉淀并转移到流式管中，上机检测；
⑫ 结束后将实验文件以fcs的格式导出，在Flowjo软件上进行分析。
3. 上机注意事项

① 设置仪器电压应该遵循两点：
a）避免阴性信号过强，一般在坐标轴103之前；
b）阳性信号必须在仪器检测范围内，否则后续无法分析数据。
② 对于多色流式，需要利用单染管来测量补偿值。
③ 收集细胞的数量没有严格的要求，但是对于稀有的细胞群，收集的细胞量大才有助于分析。

结果分析

“圈门”贯穿流式细胞术结果分析的整个过程，可以通过“门”来得到自己感兴趣的细胞群，关于圈门后期内容会展开介绍，本期我们先来看看流式结果图。
流式实验的结果图通常有三种：散点图（也称为密度图）、直方图和等高线图。
直方图：显示一个通道的信息，y轴表示细胞数，x轴表示该通道的荧光信号值。
散点图：能够同时表示两个通道的信息，图中每一点代表一个细胞。
等高线图：流式等高线图与散点图相似，也能同时显示两个通道的信息，不同的是它借助地理等高线图的形式来表现细胞群。其中的环线代表细胞密度相同的区域，越密集的地方表示此区域细胞密度变化越快，环线的中央区域代表细胞聚集的中心。相比之下，散点图更加直观，但是当细胞分群不够明显时等高线图的优势就显现出来，因为一个等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，也就是一个细胞群，这样能够帮助我们准确判断细胞的群数。



图4 三种类型的流式结果图（源于Proteintech）

1. 散射光信号分析

散射光信号是流式细胞术中初步区分细胞大小和复杂性的关键参数。
前向散射光（Forward scatter，FSC）主要反映细胞的大小，FSC强则细胞较大，反之则细胞较小。而侧向散射光（Side scatter，SSC）则与细胞内部结构的复杂性相关，通常一个细胞内部细胞器和颗粒越多，其SSC就越强。
图5为散点图，横轴代表FSC信号强度，纵轴代表SSC信号强度，颜色越红表示聚集在此地方的细胞越多。人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）包含多种不同类型的细胞（图5左），小鼠脾脏细胞主要是淋巴细胞（图5右），通过FSC和SSC即可初步将淋巴细胞、单核细胞、死细胞和细胞碎片区分开来。
死细胞和细胞碎片通常表现出较低的FSC信号，一般位于散点图的左下角区域，可以通过调整FSC的阈值来排除这些细胞；淋巴细胞胞体较小，胞内复杂程度较低，为黑色框标示区域；单核细胞胞体较大，细胞内部较为复杂，因此位于淋巴细胞群的上方。



图5 人PBMCs流式散点图（源于Proteintech）



图5 小鼠脾脏细胞流式散点图（源于Proteintech）

因为流式细胞术的分析对象是单个细胞，在实验过程中可能会存在双细胞或多细胞复合物的影响。这些粘连体在通过激光检测点时，检测装置仍然认为它们是一个信号，所以在圈定所需要的细胞群后需要进行一个去除粘连体的操作。这个过程涉及到流式细胞仪的三个参数A（Area，图5横纵轴标题FSC-A和SSC-A中的A即为此意）、H（Height）和W（Width）。当细胞从进入激光检测点到离开，电脉冲信号由0到达峰值再降为0，被记录成一个峰值（图6）。



图6 流式参数A、H、W（源于Proteintech）

H代表电脉冲信号的高度，表示信号的强度，W代表脉冲信号的宽度，也就是细胞通过激光检测点的时间，A表示电脉冲信号的面积，是通过H和W的数值计算得来，因此在仪器上分辨率会更高。粘连体的脉冲信号通常是两个或多个单细胞的合并，H相等，但是W和A会大于单个细胞，所以我们可以利用这种差异将二者区分开来。有以下两种方法：
H和W：由于粘连体的W大于单个细胞的W，因此可以使用FCS-H和FSC-W来去除粘连细胞。但是如果检测样本中各种细胞大小差异较大，那么这种方法就不太适用，不能确定是粘连体还是细胞差异问题。
A和H：正常单个细胞的H和A是成比例增大的，以FSC-A和FSC-H为坐标的散点图中单个细胞群应该是大约呈45°角分布（如图7中黑色框标示的细胞）。但是当粘连体通过时，H不变，A增大，因此也可以通过FSC-A和FSC-H来排除粘连体。



图7 人PBMCs流式散点图（源于Proteintech）



图7 小鼠脾脏细胞流式散点图（源于Proteintech）

如果粘连体太多，即使在分析数据时排除，对实验结果的影响依然很大，也容易造成流式细胞仪的管路堵塞。因此，我们需要在样本制备阶段尽可能的减少粘连体的产生。整个实验过程都应该在冰上操作，组织样本需要充分消化并吹散混匀。上机前用200目的滤网过滤，并且吹打均匀，切勿长时间静置。
2. 荧光信号分析

在去除粘连体圈门后，需要对这群细胞进行荧光信号分析，这是流式实验结果分析的核心步骤，用于分析细胞在组织中的比例或者细胞表面或内部标志物的表达情况。其中非常重要的一点是如何界定阴性细胞和阳性细胞。对于颜色较为单一的流式实验可以根据同型对照来进行阴阳群的划分。
对于双参数散点图我们通常会使用“十字门”将图分为四个象限，根据流式抗体相对应的同型对照来确定十字门的位置，右上为双阳细胞，右下为x轴所表示标志物的单阳细胞，左上为y轴所表示标志物的单阳细胞，左下为双阴细胞，四个象限中的数字表示该细胞群占我们所圈的单个细胞群的比例，x轴和y轴上的数字表示荧光强度。现在以具体例子来进行简单说明。
图8是使用APC标记人CD3抗体（货号：APC-65570）和FITC标记人CD19 抗体（货号：FITC-65197）分析人PBMCs中T细胞和B细胞的散点图；CD3是T细胞的标志物，CD19是B细胞的标志物。
其中人CD3抗体亚型为mouse IgG2a，因此我们以相同染料APC标记的mouse IgG2a同型对照抗体染色的细胞作为阴性对照来画门。在“十字门”的四个象限中，右上为CD19+CD3+细胞，右下为CD19+CD3-细胞（CD19单阳细胞，即B细胞群），左上为CD19-CD3+细胞（CD3单阳细胞，T细胞群），左下为CD19-CD3-细胞（双阴细胞）。人PBMCs中B细胞的比例较低，从图8中的样本数据可以看到CD19+CD3-细胞的比例只有12.1%。



图8 人PBMCs双参数散点图（源于Proteintech）

图9是使用CL647标记小鼠CD3抗体（货号：CL647-65077）和FITC标记小鼠CD19抗体（货号：FITC-65290）来分析小鼠脾脏中T细胞和B细胞的散点图。其中小鼠CD19抗体亚型为Rat IgG2a，因此我们以相同染料FITC标记的Rat IgG2a同型对照抗体染色的细胞作为阴性对照来画门。
小鼠脾脏中主要为B细胞，在“十字门”的四个象限中，我们可以看到左上区域的CD19+CD3-细胞占比为52.6%，其比例远远高于人PBMCs。



图9 小鼠脾脏细胞双参数散点图（源于Proteintech）

双参数散点图主要突出的是细胞比例，而直方图反应的是荧光强度。直方图纵轴代表相对细胞数量，横轴则代表荧光强度。
图10中蓝色曲线表示的是同型对照，红色表示的是APC标记人CD3抗体染色之后的人PBMCs，有两个峰，其中与同型对照重叠的为阴性峰，右侧为阳性峰，是T细胞群。可见阴性峰的荧光强度在小于104，阳性峰的位置在104到106之间。直方图中峰的位置越往右，代表其荧光强度越强。



图10 人PBMCs流式直方图（源于Proteintech）

由于篇幅有限，本期的介绍就到这里啦~
后面【流式专栏】系列文章会针对一些重点概念、实验设计、实验难点、实验案例逐渐深入，望大家期待呀！

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【参考文献】
[1] Moldavan A. Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells [J]. Science, 1934, 80(2069): 188-189.
[2] Gucker F T, Jr., O'Konski C T, et al. A photoelectronic counter for colloidal particles [J]. J Am Chem Soc, 1947, 69(10): 2422-2431.
[3] Welsh J A, Arkesteijn G J A, Bremer M, et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry [J]. J Extracell Vesicles, 2023, 12(2): e12299.

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