ELISA专栏 | 一文解答ELISA所有疑问-上篇

营养师

本系列推文可解答任何您关于ELISA实验的疑问。
ELISA实验大家一定不陌生，网上各种“指南”、“宝典”也是层出不穷，令人眼花缭乱，但好像都点到即止，并不完全解渴。这不，小P带着全网最详细最全面的ELISA知识向您走来啦！
因内容太多，我们分为了上中下三部分。上篇主要为大家介绍ELISA的基本原理、应用、分类及优缺点、实验步骤等基础科普内容；中篇则主要讲解ELISA的样本制备细节、其他实验细节优化、常见问题解析以及非常重要的ELISA实验结果解读；下篇则主要教大家如何挑选合适的ELISA试剂盒。
感兴趣的友友们可以持续关注一下！
什么是酶联免疫吸附实验 (ELISA)？

酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种对目的分子（如肽、蛋白、抗原、抗体和小分子等）定性或定量的检测方法，也是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一。鉴于其强大的特异性和便捷性，ELISA通常被视为生物样品定量检测的金标准。
ELISA的原理是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应来判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng/mL）水平甚至皮克（pg/mL）水平。
ELISA最初由斯德哥尔摩大学的Peter Perlmann和Eva Engvall以及荷兰Organon实验室的Anton Schuurs和Bauke van Weemen两个研究小组于1971年几乎同时提出[1]，也就是现在的直接法ELISA技术。
此后，日本宮崎大学和德岛大学科研团队在直接法的基础上进一步升级，于1977年研发出了夹心法ELISA技术[2]。夹心法ELISA基于抗体对研发，比直接法特异性更高，同时还无需抗原纯化，能适用于更复杂的样本。
划重点：ELISA操作方便、特异性强、数据分析简单、既可定性也可定量，结果明确易于解释，并且！它还经济实惠。
那么，这么强大的技术它都可以用来干嘛呢？
ELISA 用来检测和测定什么？

ELISA既可用于单份样品检测又可用于高通量筛选，可分析并定量各种样品类型（如细胞裂解物、组织裂解物或血清、血浆）中的一种或多种目标分析物，被广泛应用于临床诊断、药物研究和生命科学基础研究等各个领域，其按应用可分为研究工具和诊断工具两类。
ELISA作为研究工具

许多研究领域都会用到ELISA技术，其可以帮助研究人员了解细胞和组织中蛋白质的表达和调控，如磷酸化特异性和总蛋白评估、分泌蛋白表达、翻译后修饰评估、免疫学研究、神经学研究、癌症研究等。ELISA在药物的研发与监测中也发挥着重要作用，可用于筛选化合物库，以确定其与特定蛋白质的结合能力，从而识别潜在的候选药物以供进一步开发。同时，ELISA可用于监测血液或尿液中的药物或其代谢物的水平，以确保药物处于治疗水平且无毒性。
ELISA作为诊断工具

除了用于科学研究之外，ELISA还广泛用于诊断检测，包括对病毒感染、过敏测试、毒性和癌症的诊断检测，是一种快速便捷的临床检测手段，这种检测在扩展后可同时检测多份样品。
目前常见的ELISA方法共有4种，他们各有什么优劣势？原理有又有何不同呢？
ELISA分类及优缺点

目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法。


直接法ELISA：利用固相抗原与酶标一抗之间的抗原抗体反应来检测抗原含量。抗原被动附着在固相载体（一般为96孔板）上，然后添加与酶（最常见的为HRP或AP）偶联的酶标一抗来检测抗原。经过孵育和洗涤后，添加显色底物（如TMB），利用酶的催化作用将无色底物转化为有色产物，短暂孵育并添加停止液终止酶活性后，读取显色情况。
间接法ELISA：间接法ELISA是检测抗体常用的方法。其在直接ELISA的基础上添加酶联二抗检测与固相抗原结合的受检抗体。总的来说，遵循直接ELISA的前几个步骤，包括固定抗原和封闭，添加一抗，但与直接ELISA不同，该一抗未偶联。然后添加相应的酶标二抗来检测该一抗，之后添加显色底物和停止液，最后读取显色情况。
竞争法ELISA（也称抑制或封闭 ELISA）：通过定量样品中非目标分析物的含量，来侧面确定目标分析物的含量。检测信号与样品中目标分析物的含量呈负相关。其原理是样本抗原与参比抗原竞争结合特定数量的酶标一抗，将参比抗原包被到固相载体上，然后将样本与酶标抗体一起孵育，游离抗体会与参比抗原结合，样本中的目标抗原越多，与参比抗原结合的标记抗体越少，信号越弱。
双抗夹心法ELISA：双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。其将捕获抗原的抗体（捕获抗体）结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标抗体（检测抗体），与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体一抗原一固相抗体复合物，最后加底物显色，判断抗原含量。



图1 双抗夹心法ELISA流程图

上文我们提到，ELISA是通过酶作用于底物后的显色反应来判定结果，那都有哪些结果检测方法呢？
ELISA的结果检测方法

ELISA检测方法有很多，目前实验室中最普遍的方法是显色、荧光和化学发光法。这些方法取决于抗体的偶联物（通常是HRP或AP），在检测时，添加这些酶的底物，以产生比色、荧光或化学发光信号。使用的底物类型往往由多种因素决定，主要是根据所需的检测灵敏度和信噪比来选择。
显色法（比色法）

最常见的 ELISA 检测类型是比色检测。其原理是辣根过氧化物酶 (HRP-) 或碱性磷酸酶 (AP-) 偶联抗体与一种显色底物（例如TMB）溶液结合发生酶促反应。这种检测方通常使用酶标仪来测定各样品孔吸光度，互相比较样品，或用已知分析物浓度制成的标准曲线来确定样品浓度，一般使用透明孔板进行实验。
化学发光法

偶联AP或HRP的检测抗体还可用化学发光检测，在检测前同时添加过氧化物底物和鲁米诺，AP或HRP 会氧化鲁米诺，从而在 425 nm 处发光，该方法一般采用光度计读取信号。这种检测类型的优势是动态范围通常更宽，背景信号更弱，因此灵敏度提高。但信号不如其他两种检测类型稳定，并且产生信号后必须短时间内读取数据。当需要一个较大的动态范围时，通常使用化学发光检测。该方法一般在不透明的白色平板上进行。
荧光法

该种方法使用过氧化物酶偶联的检测抗体（即AP和HRP）和荧光底物反应。这种方法可以提供更强的信号和更宽的动态范围；但荧光底物的半衰期较比色底物短，因此，信号会在一段时间之后减弱。荧光检测需要使用黑色多孔板来最大程度地减少背景。此外，还需要使用荧光计读取信号。这类 ELISA 可用来检测免疫应答。另外，如果待测分子对于夹心检测而言太小，则推荐使用该方法。
最后我们以双抗夹心法ELISA为例，为大家讲述一下ELISA的实验步骤。
ELISA实验步骤(以双抗夹心法ELISA为例)

样本准备

ELISA实验适用于各种样品类型（如血液、尿液和裂解细胞），样品制备方法取决于样品类型以及待解决的实验问题。样品制备环节对实验结果影响重大，需要尤为注意（由于篇幅有限，将在下周推文中具体讲解）。
操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。
1. 包被抗体：用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS），将包被抗体稀释到一定的浓度， 100 μl/孔包被， 37℃ 2h 或者 4℃过夜。
2. 洗板：弃孔内液体，甩干，10 mM PBST(10 mM PBS+0.05% Tween-20) 洗板2次（或使用 ELISA 洗涤液（20X），货号：PR10007），每次浸泡1-2 min， 350 μl/ 孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
3. 封闭：含1%BSA或者5%脱脂牛奶的10 mM PBST做封闭液，350-400μl/ 孔，37℃ 2h。
4. 洗板：同步骤2。（备注：商品化的试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤）。
5. 加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。（注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品。）酶标板加上覆膜，37℃反应60 min-120 min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
6. 洗板：同步骤2。
7. 加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用 PBST 稀释到一定的稀释度 [推荐使用 ELISA 通用稀释液(5X)，货号：PR10008]。
8. 洗板：同步骤2。
9. 加二抗：根据实验需要，将二抗用10 mM PBST稀释到一定的稀释度 [推荐使用 ELISA 通用稀释液(5X)，货号：PR10008]。
10. 洗板：同步骤2。
11. 显色：每孔加TMB显色液100 μl，室温避光显色15-20 min，显蓝色，若颜色偏浅，可放在37℃显色，不超过30 min。（双组分TMB显色试剂盒，货号：PK10004）
12. 终止：每孔加终止溶液100 μl，此时蓝色变为黄色（ELISA 终止液，货号：PR10009）。
13. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值），在加终止液后5 min内进行读数。
14. 结果判断：
a. 每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；
b. 以标准品的浓度为横坐标， OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、 ELISACalc等，根据样品的 OD 值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。

好啦，本期的ELISA基础知识讲解就到这里啦，欲知后事如何，且听下回分解～下期将为您带来ELISA的样本制备细节、其他实验细节优化、常见问题解析以及非常重要的ELISA实验结果解读。



参考文献
[1] Engvall E, Jonsson K, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure, 1971, 251(3): 427-434.2.
[2] Kato K, Hamaguchi Y, Okawa S, et al. Use of rabbit antibody IgG bound onto plain and aminoalkylsilyl glass surface for the enzyme-linked sandwich immunoassay. J Biochem. 1977, 82(1):261-266.

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