7-AAD 细胞活力流式细胞术实验方案

检验之星

流式细胞术细胞活力概述
流式细胞术提供了一种快速可靠的方法来量化细胞悬液中的活细胞。 在评估细胞的生理状态时，例如对细胞毒性药物和环境因素的反应，或在癌症和其他疾病状态的进展过程中，确定细胞活力至关重要。 此外，通常需要检测细胞悬液中的死细胞，以便将其排除在分析之外。 由于非特异性抗体结合或不需要的荧光探针摄取，死细胞会产生伪影。 识别这两个细胞群的一种方法是通过染料排除。 活细胞具有完整的膜，可排除多种染料，这些染料很容易穿透无活力细胞的受损、可渗透的膜。
几种不同的荧光染料可用于染色非活细胞，包括 7-氨基放线菌素 D (7-AAD)。 7-AAD 是一种膜不透性染料，通常被活细胞排除在外。 它通过插入富含 G-C 区域的碱基对与双链 DNA 结合。 7-AAD 可以用氩激光在 488 nm 处激发。 它具有相对较大的斯托克斯位移，最大波长为 647 nm。 由于这些光谱特性，7-AAD 可以与其他在 488 nm 处激发的荧光染料结合使用，例如异硫氰酸荧光素 (FITC) 和藻红蛋白 (PE)。
以下方案已由 R&D Systems 流式细胞术实验室开发和优化，用于使用 7-AAD 进行细胞活力染色。




所需试剂

• PBS (1X)：0.137 M NaCl、0.05 M NaH2PO4、pH 7.4 或 Hank 平衡盐溶液 (HBSS；1X)
  
• 流式细胞染色缓冲液或含有 BSA 和叠氮化钠的等效溶液
  
• 7-AAD 染色溶液：1 mg/mL 7-AAD 在 PBS 中（在黑暗中储存在 2-8 °C）
  

所需材料

• FACS™ 管（5 mL 圆底聚苯乙烯管）
  
• 移液器吸头和移液器
  
• 离心机
  
• 涡旋
  

步骤
1.收获细胞并将最多 1 x 106 个细胞/100 μL 等分到 FACS 管中。通过加入 2 mL PBS（或 HBSS）清洗细胞，以 300 x g 离心 5 分钟，然后从沉淀的细胞中倾析缓冲液。重复洗涤步骤共 2 次。
注意：此时可以使用抗体对细胞表面抗原进行染色。标记细胞内分子时不能使用 7-AAD。
2.在 100 μL 流式细胞仪染色缓冲液中重悬细胞。
3.要调整 7-AAD 的流式细胞仪设置，请将 5-10 μL 的 7-AAD 染色溶液添加到未染色细胞的控制管中。轻轻混合并在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
4.使用 FACScan™ 仪器测定 7-AAD 荧光（使用 FL-2 或 FL-3 通道）。
注意：如果仅使用 7-AAD 染色，则使用 FL-2 通道。如果细胞也被 FITC 和/或 PE 偶联抗体染色，则在 FL-3 通道中收集 7-AAD 荧光。
5.获取未染色细胞和单色阳性对照的数据。
6.在每个样品中加入 5-10 μL 的 7-AAD 染色溶液，并在分析前在 4 °C 下在黑暗中孵育 30 分钟。从前向散射与 7-AAD 的点图中设置活细胞的停止计数。
注意：加入 7-AAD 染色液后不要洗涤细胞。

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