SignalP+TMHMM预测微生物分泌蛋白

病理医师

Secretory Protein是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的蛋白质。分泌蛋白的N 端有一般由15～30 个氨基酸组成的信号肽。信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个氨基酸）肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。使用SignalP 注释蛋白序列是否含有信号肽结构，使用TMHMM注释蛋白序列是否含有跨膜结构，最终筛选出含有信号肽结构并且不含跨膜结构的蛋白为分泌蛋白。

软件Software

• SignalP V6.0
  
• SignalP 6.0 预测来自古细菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真核生物的蛋白质中存在的信号肽predicts signal peptides and the location of their cleavage sites in proteins from Archaea, Gram-positive Bacteria,及其切割位点的位置。Gram-negative Bacteria and Eukarya.在细菌和古细菌中，SignalP 6.0 可以区分五种类型的信号肽：In Bacteria and Archaea, SignalP 6.0 can discriminate between five types of signal peptides:
  
  
  
  • Sec/SPI：由 Sec 转座转运，并由信号肽酶 I (Lep) 切割的“标准”分泌信号肽；"Standard" secretory signal peptides transported by Sec translocon and cleaved by Signal Peptidase I (Lep).
    
  • Sec/SPII：由 Sec 转座子运输，并由信号肽酶 II (Lsp) 切割的脂蛋白信号肽；lipoprotein signal peptides transported by the Sec translocon and cleaved by Signal Peptidase II (Lsp).
    
  • Tat/SPI：由 Tat 转座子转运，并由信号肽酶 I (Lep) 切割的 Tat 信号肽；Tat signal peptides transported by the Tat translocon and cleaved by Signal Peptidase I (Lep).
    
  • Tat/SPII：由 Tat 转位子转运，并由信号肽酶 II (Lsp) 切割的 Tat 脂蛋白信号肽；Tat lipoprotein signal peptides transported by Tat translocon & cleaved by Signal Peptidase II (Lsp).
    
  • Sec/SPIII：由 Sec 转位子运输，并由信号肽酶 III (PilD/PibD) 切割的菌毛蛋白和菌毛蛋白样信号肽。Pilin & pilin-like signal peptides transported by Sec translocon & cleaved by Signal Peptidase III (PilD/PibD).
    
  • 此外，SignalP 6.0 预测信号肽的区域。Additionally, SignalP 6.0 predicts the regions of signal peptides.根据类型，预测 n、h 和 c 区域以及其他显着特征的位置。Depending on the type, the positions of n-, h- and c-regions as well as of other distinctive features are predicted.
    
  
  

• TMHMM V2.0c
  
  
  
  • 用于预测蛋白质中的跨膜螺旋。
    
  
  

• Python
  

SignalP和TMHMM对于学术用户免费，但是需要填写相关信息和邮箱，以接收下载链接（4h有效时间）。

软件安装Installation of Softwares


安装SignalP 6.0

• 下载
  访问SignalP V6.0网站，找到“Download”，填写相关信息，获取下载链接，下载得到“signalp-6.0.fast.tar.gz”。有两个模式可以选择——“slow_sequential”和“fast"。前者runs the full model sequentially, taking the same amount of RAM as fast but being 6 times slower；后者uses a smaller model that approximates the performance of the full model, requiring a fraction of the resources and being significantly faste。本教程下载的是fast模式。
  
• 安装Installation
  
  
  
  • 安装依赖Dependencies
    
    
    
    • Python
      
    • matplotlib>3.3.2
      
    • numpy>1.19.2
      
    • torch>1.7.0
      pip install torch
      
    • tqdm>4.46.1
      
    
    
  
  

• 安装SignalP 6.0
  # 解压缩安装文件 tar zxvf signalp-6.0.fast.tar.gz  # 进入解压后的软件目录，在终端运行 python setup.py install  # 测试安装 signalp6 --help
  

安装TMHMM V2.0c

• 下载
  访问TMHMM V2.0c网站，找到“Download”，填写相关信息，获取下载链接，下载得到“tmhmm-2.0c.Linux.tar.gz”。
  
• 安装
  # 解压缩 tar zxvf tmhmm-2.0c.Linux.tar.gz  # 进入解压后的目录 cd tmhmm-2.0c  # 获取当前路径，我的是“/home/liu/tools/tmhmm-2.0c/bin” pwd # 将该路径加入到系统的环境变量中，参考我之前的文章来（编辑~/.bashrc）https://liaochenlanruo.github.io/post/f6c9.html#%E6%B7%BB%E5%8A%A0%E7%8E%AF%E5%A2%83%E5%8F%98%E9%87%8F # 修改bin目录下的tmhmm和tmhmmformat.pl的首行为“#!/usr/bin/perl”
  
• 运行错误
  运行软件时总报Segmentation fault (core dumped)错误，暂时无解。各位可以使用其在线版。
  

软件用法Usage


SignalP 6.0


预测Prediction

A command takes the following form
signalp6 --fastafile /path/to/input.fasta --organism other --output_dir path/to/be/saved --format txt --mode fast

• fastafile 输入文件为FASTA格式的蛋白序列文件Specifies the fasta file with the sequences to be predicted.。
  
• organism is either other or Eukarya. Specifying Eukarya triggers post-processing of the SP predictions to prevent spurious results (only predicts type Sec/SPI).
  
• format can take the values txt, png, eps, all. It defines what output files are created for individual sequences. txtproduces a tabular .gff file with the per-position predictions for each sequence. png, eps, all additionally produce probability plots in the requested format. For larger prediction jobs, plotting will slow down the processing speed significantly.
  
• mode is either fast, slow or slow-sequential. Default is fast, which uses a smaller model that approximates the performance of the full model, requiring a fraction of the resources and being significantly faster. slow runs the full model in parallel, which requires more than 14GB of RAM to be available. slow-sequential runs the full model sequentially, taking the same amount of RAM as fast but being 6 times slower. If the specified model is not installed, SignalP will abort with an error.
  

输出Outputs

• output_dir/output.gff3：仅包含含有信号肽的序列信息；
  

• output_dir/prediction_results.txt：包含了输入文件中的所有序列（不重要）；
  
• output_dir/region_output.gff3：包含所有的信号肽区域信息。
  
  
  
  • n-region: The n-terminal region of the signal peptide. Reported for Sec/SPI, Sec/SPII, Tat/SPI and Tat/SPII. Labeled as N
    
  • h-region: The center hydrophobic region of the signal peptide. Reported for Sec/SPI, Sec/SPII, Tat/SPI and Tat/SPII. Labeled as H
    
  • c-region: The c-terminal region of the signal peptide, reported for Sec/SPI and Tat/SPI.
    
  • Cysteine: The conserved cysteine in +1 of the cleavage site of Lipoproteins that is used for Lipidation. Labeled as c.
    
  • Twin-arginine motif: The twin-arginine motif at the end of the n-region that is characteristic for Tat signal peptides. Labeled as R.
    
  • Sec/SPIII: These signal peptides have no known region structure.
    
  
  

批处理与结果优化

脚本名：run_SignalP.pl
#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu Hualin
# Date: Oct 14, 2021

open IDNOSEQ, ">IDNOSEQ.txt" || die;
my @faa = glob("*.faa");
foreach  (@faa) {
        $_ =~ /(.+).faa/;
        my $str = $1;
        my $out = $1 . ".nodesc";
        my $sigseq = $1 . ".sigseq";
        my $outdir = $1 . "_signalp";
        open IN, $_ || die;
        open OUT, ">$out" || die;
        while (<IN>) {
                chomp;
                if (/^(>\S+)/) {
                        print OUT $1 . &#34;\n&#34;;
                }else {
                        print OUT $_ . &#34;\n&#34;;
                }
        }
        close IN;
        close OUT;
        my %hash = idseq($out);
        system(&#34;signalp6 --fastafile $out --organism other --output_dir $outdir --format txt --mode fast&#34;);
        my $gff = $outdir . &#34;/output.gff3&#34;;
        if (! -z $gff) {
                open IN, &#34;$gff&#34; || die;
                <IN>;
                open OUT, &#34;>$sigseq&#34; || die;
                while (<IN>) {
                        chomp;
                        my @lines = split /\t/;
                        if (exists $hash{$lines[0]}) {
                                print OUT &#34;>$lines[0]\n$hash{$lines[0]}\n&#34;;
                        }else {
                                print IDNOSEQ $str . &#34;\t&#34; . &#34;$lines[0]\n&#34;;
                        }
                }
                close IN;
                close OUT;
        }
        system(&#34;rm $out&#34;);
        system(&#34;mv $sigseq $outdir&#34;);
}
close IDNOSEQ;
sub idseq {
        my ($fasta) = @_;
        my %hash;
        local $/ = &#34;>&#34;;
        open IN, $fasta || die;
        <IN>;
        while (<IN>) {
                chomp;
                my ($header, $seq) = split (/\n/, $_, 2);
                $header =~ /(\S+)/;
                my $id = $1;
                $hash{$id} = $seq;
        }
        close IN;
        return (%hash);
}
将run_SignalP.pl与后缀名为“.faa”的FASTA格式文件放在同一目录下，在终端中运行如下代码：
perl run_SignalP.pl

结果解读Output interpretation

*代表输入文件的名字。

• *_signalp/output.gff3：仅包含含有信号肽的序列信息；
  
• *_signalp/prediction_results.txt：包含了输入文件中的所有序列（不重要）；
  
• *_signalp/region_output.gff3：包含所有的信号肽区域信息;
  
• *_signalp/*.sigseq：存储所有信号肽的氨基酸序列文件，可用作TMHMM的输入文件。
  

TMHMM


预测

离线版总是报错，找不出原因，因此使用网页服务器进行，输入文件为上述生成的“*_signalp/*.sigseq”，将其上传至网页版TMHMM，提交任务，等待结果即可。

结果展示

TMHMM可以输出多种格式的结果文件，具体请参考其官方说明。



在TMHMM网站提交任务

• Long output format
  
  
  
  • Length： 蛋白序列的长度。The length of the protein sequence.
    
  • Number of predicted TMHs：预测到的跨膜螺旋的数量。The number of predicted transmembrane helices.
    
  • Exp number of AAs in TMHs：跨膜螺旋中氨基酸的预期数量。The expected number of amino acids intransmembrane helices. 如果此数字大于 18，则很可能是跨膜蛋白（或具有信号肽）。If this number is larger than 18 it is very likely to be a transmembrane protein (OR have a signal peptide).
    
  • Exp number, first 60 AAs：在蛋白的前60个氨基酸中跨膜螺旋中氨基酸的预期数量。The expected number of amino acids in transmembrane helices in the first 60 amino acids of the protein.如果该数字超过几个，你应该被警告在 N 端预测的跨膜螺旋可能是一个信号肽。If it more than a few, you are warned that a predicted transmembrane helix in the N-term could be a signal peptide.
    
  • Total prob of N-in：N端在膜的细胞质一侧的总概率。The total probability that the N-term is on the cytoplasmic side of the membrane.
    
  • POSSIBLE N-term signal sequence：当“Exp number, first 60 AAs”大于 10 时产生的警告。A warning that is produced when &#34;Exp number, first 60 AAs&#34; is larger than 10.
    
  
  

• 蛋白F01_bin.1_00110共计436个氨基酸，有5个跨膜螺旋结构。
  

• 蛋白F01_bin.1_00142共计557个氨基酸，所有序列均在膜外，即该序列编码的是分泌蛋白。
  

• Short output format
  
  
  
  • &#34;len=&#34;： 蛋白序列的长度。The length of the protein sequence.
    
  • &#34;ExpAA=&#34;：跨膜螺旋中氨基酸的预期数量。The expected number of amino acids intransmembrane helices.如果此数字大于 18，则很可能是跨膜蛋白（或具有信号肽）。If this number is larger than 18 it is very likely to be a transmembrane protein (OR have a signal peptide).
    
  • &#34;First60=&#34;：在蛋白的前60个氨基酸中跨膜螺旋中氨基酸的预期数量。The expected number of amino acids in transmembrane helices in the first 60 amino acids of the protein.如果该数字超过几个，你应该被警告在 N 端预测的跨膜螺旋可能是一个信号肽。If it more than a few, you are warned that a predicted transmembrane helix in the N-term could be a signal peptide.
    
  • &#34;PredHel=&#34;：预测到的跨膜螺旋的数量。The number of predicted transmembrane helices by N-best.
    
  • &#34;Topology=&#34;：N-best 预测的拓扑结构。The topology predicted by N-best.拓扑是由跨膜螺旋的位置给出的，如果螺旋在内部，则由“i”分隔，如果螺旋在外部，则由“o”分隔。&#39;i7-29o44-66i87-109o&#39;意味着它从膜内开始，在位置7到29有一个预测的TMH，30-43在膜外，然后是位置44-66的TMH。
    
  
  

结果汇总

通过网页版预测我们仅得到了一个列表文件（Short output format），该文件需要自己复制网页内容粘贴到新文件中，我将其命名为*_TMHMM_SHORT.txt，并将其存放在*_signalp目录中，该目录是由run_SignalP.pl生成的。下面我将会统计各个基因组中信号肽蛋白的总数量、分泌蛋白数量和跨膜蛋白数量到文件Statistics.txt中，并分别提取每个基因组的分泌蛋白序列到*_signalp/*.secretory.faa文件中，提取跨膜蛋白序列到*_signalp/*.membrane.faa文件中。该过程将通过tmhmm_parser.pl完成。
#!/usr/bin/perl use strict; use warnings; # Author: Liu Hualin # Date: Oct 15, 2021 open OUT, &#34;>Statistics.txt&#34; || die; print OUT &#34;Strain name\tSignal peptide numbers\tSecretory protein numbers\tMembrane protein numbers\n&#34;; my @sig = glob(&#34;*_signalp&#34;); foreach my $sig (@sig) {         $sig=~/(.+)_signalp/;         my $str = $1;         my $tmhmm = $sig . &#34;/$str&#34; . &#34;_TMHMM_SHORT.txt&#34;;         my $fasta = $sig . &#34;/$str&#34; . &#34;.sigseq&#34;;         my $secretory = $str . &#34;.secretory.faa&#34;;         my $membrane = $str . &#34;.membrane.faa&#34;;         open SEC, &#34;>$secretory&#34; || die;         open MEM, &#34;>$membrane&#34; || die;         my $out = 0;         my $on = 0;         my %hash = idseq($fasta);         open IN, $tmhmm || die;         while (<IN>) {                 chomp;                 $_=~s/[\r\n]+//g; #                print $_ . &#34;\n&#34;; my @lines = split /\t/;                 if ($lines[5] eq &#34;Topology=o&#34;) {                         $out++;                         print SEC &#34;>$lines[0]\n$hash{$lines[0]}\n&#34;;                 }else {                         $on++;                         print MEM &#34;>$lines[0]\n$hash{$lines[0]}\n&#34;;                 }         }         close IN;         close SEC;         close MEM;         system(&#34;mv $secretory $membrane $sig&#34;);         my $total = $out + $on;         print OUT &#34;$str\t$total\t$out\t$on\n&#34;; }  close OUT;  sub idseq {         my ($fasta) = @_;         my %hash;         local $/ = &#34;>&#34;;         open IN, $fasta || die;         <IN>;         while (<IN>) {                 chomp;                 my ($header, $seq) = split (/\n/, $_, 2);                 $header =~ /(\S+)/;                 my $id = $1;                 $hash{$id} = $seq;         }         close IN;         return (%hash); }
运行方法：将tmhmm_parser.pl放在*_signalp的上一级目录下，*_signalp目录中必须包含*_TMHMM_SHORT.txt文件和*.sigseq文件。在终端运行如下代码：
perl tmhmm_parser.pl

脚本获取

本文脚本见GitHub。
敬告：使用文中脚本请引用本文网址，请尊重本人的劳动成果，谢谢！Notice: When you use the scripts in this article, please cite the link of this webpage. Thank you!

参考

• SignalP V6.0
  
• TMHMM
  

原文链接：SignalP+TMHMM预测微生物分泌蛋白 | liaochenlanruo
转载请注明出处！
http://weixin.qq.com/r/HUzl-XvE6CaXrT_e9xkP (二维码自动识别)

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/423757806